De transwellmigratietest is een klassieke techniek die wetenschappers in staat stelt celbeweging te kwantificeren. Migratie verwijst naar het vermogen van een cel om zich individueel of in clusters te verplaatsen. Celbewegingen worden mogelijk gemaakt door nauwkeurige herstructurering van hun cytoskelet en migratie treedt meestal op in reactie op stimuli die fungeren als cues.
Vandaag bespreken we de transwell migratie assay, die gebruik maakt van een eenvoudige kamer setup om migratie te beoordelen in reactie op het aantrekken van cues.
We beginnen met het verstrekken van enige achtergrondinformatie over de transwell kamer.
Het apparaat werd voor het eerst ontworpen door Dr. Stephen Boyden in 1961, die het gebruikte om de migratie van leukocyten te bestuderen. Daarom is deze methode ook bekend als de Boyden chamber assay.
In een eenvoudige Boyden-kamer is de buitenwand van de putjes, zoals die van een 96-wells-plaat. Binnen elke well wordt een transwell, een cilindervormig inzetstuk, geplaatst. Het inzetstuk heeft een polycarbonaatmembraan met een bepaalde poriegrootte. Wanneer het in de well wordt geplaatst, verdeelt het de kamer in twee compartimenten. In het bovenste compartiment worden de cellen gezaaid waarvan het migratiegedrag moet worden bestudeerd, en in het onderste reservoir wordt de oplossing van de chemo-attractant geplaatst. Per definitie is een chemoattractant een molecule die de beweeglijkheid van cellen kan bevorderen door “cellen aan te trekken”.
Door deze aantrekkingskrachten migreren cellen in het bovenste compartiment door de poriën naar het onderste reservoir. Als de cellen adherente eigenschappen hebben, zoals sommige melanoomcellen, zullen zij zich na de beweging “vasthechten” aan de onderkant van het membraan. In dit geval kan het membraan worden gefixeerd, gekleurd en kunnen de cellen onder de microscoop worden geteld. Anderzijds zullen niet-adherente cellen, zoals sperma, naar het onderste reservoir migreren. In dit geval kunnen de cellen in het reservoir worden geteld met behulp van een hemocytometer.
Hoewel de opzet voor deze proef eenvoudig is, zijn er toch verschillende dingen die men vóór het experiment moet overwegen. Laten we een paar van hen bekijken.
Te beginnen met de seeding oplossing, moet je ervoor zorgen dat de dichtheid is geoptimaliseerd voor cel migratie waar te nemen. Te weinig cellen kan resulteren in niet detecteerbare migratie, en grotere dichtheden zal overbevolking van het membraan, waardoor het moeilijk is om migratie opsomming. De tweede overweging is de poriegrootte van het inzetstuk. Deze moet zorgvuldig worden gekozen, afhankelijk van het celtype. Als de poriegrootte te klein is, zullen cellen niet in staat zijn te passeren.
Alternatief, als de poriegrootte te groot is, cellen zullen gewoon vallen door, dat is niet migratie. Ten slotte moet men zich bewust zijn van de chemoattractant concentratie en de incubatietijd worden toegestaan voor migratie, omdat deze van elkaar afhankelijk zijn. Een optimale concentratie met een passende incubatietijd waarin de concentratiegradiënt tussen de compartimenten wordt gehandhaafd, leidt tot celmigratie als gevolg van de chemo-attractie. Omgekeerd kan langdurige incubaties gepaard gaan met een evenwicht van chemo-attractant in de hele kamer leidt tot het verlies van chemische gradiënt, die de analyse van de verkregen resultaten kan verwarren.
Met deze overwegingen in het achterhoofd, laten we bespreken een protocol gebruikt om de migratie van adherente cellen te meten.
Cellen te worden onderzocht worden bereid in een protease-vrij medium, omdat proteasen kunnen denatureren belangrijke membraan receptoren, en uiteindelijk van invloed migratie. Nadat cellen worden bereid, moet de suspensie worden verdund tot een optimale zaaien dichtheid. Om de kamer voor te bereiden, worden transwells in putjes van een multiwellplaat geplaatst. Celsuspensie moet in de transwell worden gepipetteerd zonder het membraan aan te raken of luchtbellen te introduceren.
Chemoattractant oplossing wordt gepipetteerd in het onderste reservoir, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de oplossing raakt het membraan van het inzetstuk. De incubatietijd voor de migratie zal afhangen van de experimentele overwegingen. Na de incubatie worden de membranen gefixeerd door het inzetstuk in 70% ethanol onder te dompelen. Na het laten drogen van de insert, wordt cel kleuring oplossing toegevoegd.
Next, cellen worden geïncubeerd gedurende ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatie worden de inserts gewassen met behulp van wasbuffer. Tenslotte kan het membraan worden uitgesneden en op een microscoopglaasje worden gelegd. Cellen aan de onderkant van het membraan vertegenwoordigen het aantal cellen dat is gemigreerd in de aanwezigheid en afwezigheid van chemoattractants.
Sinds, nu heb je een gevoel voor het protocol, laten we eens een korte blik op hoe onderzoekers deze methode gebruiken in hun explorations.
Een van de meest voorkomende toepassingen van deze assay is het evalueren van chemoattractant eigenschappen van onbekende verbindingen. Hier waren wetenschappers geïnteresseerd in het onderzoeken van de zwempaden van kikkersperma in de aanwezigheid van allurine, een stof die wordt afgescheiden door amfibie-eieren. Daartoe pipetteerden zij eerst actieve kikkersperma’s naar de bovenkant van de transwell-inzetten. Aan de onderkant voegden zij allurine toe. Nadat zij de cellen hadden laten migreren, telden zij onder een microscoop de zaadcellen in de reservoiroplossing. Met behulp van deze techniek konden zij een concentratie-respons curve genereren die het effect van de allurineconcentratie op de spermamigratie weergeeft.
Wanneer een cel wordt aangevallen door pathogenen, zendt hij chemoattractanten uit om immuuncellen aan te trekken die migreren, zich hechten, en vervolgens de infectie oplossen. Om dit fenomeen te testen, kweekten deze wetenschappers epitheelcellen aan de onderzijde van de inserts. Vervolgens infecteerden zij deze cellen met verschillende bacteriestammen. Tenslotte brachten zij immuuncellen in de bovenste kamer in. Het is bekend dat de geïnfecteerde cellen verschillende chemoattractanten produceren die de migratie van immuuncellen induceren. De resultaten van dit experiment toonden aan dat neutrofielen in verschillende mate migreerden als reactie op verschillende soorten bacteriële infectie.
Kankercelinvasie en metastasering door de extracellulaire matrix heeft celbiologen altijd geïntrigeerd. Hier wilden wetenschappers bepalen hoe specifieke chemoattractanten kunnen bijdragen aan een dergelijke migratie door een 3D-matrix. Zij ontwikkelden genetisch twee afzonderlijke pools van cellen: een die groen fluorescerend eiwit tot expressie brengt, en een andere die rood fluorescerend eiwit tot expressie brengt. Vervolgens pipetteerden ze een extracellulaire matrix-mimic op de bovenkant van de transwells.
Eenmaal gestold, keerden ze de transwell om en seedden twee pools van cellen aan de onderkant van het membraan. Vervolgens plaatsten zij het inzetstuk terug in de multiwellplaat en pipetteerden de chemo-attractant oplossing in de bovenste kamer. Dit zorgde ervoor dat de cellen aan de onderkant omhoog en door de 3D-matrix bewogen. Met behulp van confocale beeldvorming, reconstrueerden deze onderzoekers celmigratie in 3D, en onderscheidden de migratiepatronen van twee groepen cellen.
Je hebt net JoVE’s video over de transwell migratie assay bekeken. Met het begrip van de componenten en het protocol van deze methode, je weet nu waarom het zo veel gebruikt door celbiologen. Ondanks de eenvoud van deze opstelling, het bereik van configuraties deze methode kan aanpassen maakt het onmisbaar voor cel motiliteit studies. Zoals altijd, bedankt voor het kijken!