Onderwerpen
Aan deze studie namen 88 behandelings-naïeve LC-patiënten zonder verre metastasen deel. Alle patiënten werden gediagnosticeerd met larynx plaveiselcelcarcinoom door pathologisch onderzoek van monsters en werden behandeld op de afdeling Otorhinolaryngologie, Hoofd en Hals Chirurgie, Universiteit van de Ryukyus, tussen januari 2008 en december 2017. De definitieve prognose van de patiënten werd beoordeeld in juli 2018. Classificatie van de tumor, knoop, metastase (TNM) stadium werd uitgevoerd volgens de AJCC Staging Manual (7e editie). Om het klinische stadium te bepalen en om concomitante meerdere primaire kankers op te sporen, ondergingen de patiënten fysieke en endoscopische onderzoeken van het bovenste maagdarmkanaal, ultrasone inspectie van de hals, computertomografie (CT), en 18F-fluorodeoxyglucose-positronemissietomografie CT-beeldvorming.
Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de University of the Ryukyus en werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki van 1975, zoals herzien in 2008. Van alle LC-patiënten werd voor de inschrijving geïnformeerde toestemming verkregen.
Behandeling
De hoofdbehandeling voor de primaire laesie met curatieve intentie was conventionele radiotherapie (RT) alleen of laserresectie in T1, gelijktijdige chemoradiotherapie (CCRT) in T2, CCRT of chirurgie in T3, en chirurgie in T4, ongeacht de aanwezigheid van HPV. Nodale laesies werden behandeld met CCRT of hals dissectie gecombineerd met resectie van de primaire laesie. Alle patiënten die RT kregen (totale dosis, 70 Gy) hadden CT-ondersteunde driedimensionale bestralingsplanning in de behandelpositie met maskerimmobilisatie. Het protocol voor CCRT was zoals eerder gerapporteerd. Wanneer de primaire tumor in T3 geen partiële respons vertoonde, ongeacht de respons op de lymfeklieren in de hals bij bestraling met 39,6 Gy, ondergingen de patiënten curatieve chirurgie voor de primaire laesie in combinatie met halsdissectie.
Detectie van HPV-status en p16-immunohistochemie
Alle weefselmonsters van primaire laesies zonder bestraling of chemotherapie werden geanalyseerd met de polymerasekettingreactie (PCR) voor HPV-DNA-detectie met behulp van vers ingevroren monsters, die werden verkregen bij biopsie of chirurgische resectie, en p16-immunohistochemie met behulp van FFPE-monsters. Gevallen met negatieve HPV-detectieresultaten op PCR en p16-overexpressie (≥75% positieve cellen en ten minste matige kleuringintensiteit) werden verder geëvalueerd voor HPV-status met behulp van in situ hybridisatie (ISH) met HPV DNA probes (DNA ISH) . Kwantitatieve real-time PCR (qPCR) voor virale belasting en fysieke status, zoals hieronder beschreven, werd uitgevoerd in gevallen met HPV-16.
PCR voor HPV DNA-detectie
In het kort werd DNA geïsoleerd uit de tumormonsters met behulp van een Gentra Puregene Tissue Kit (QIAGEN, Germantown, MD). De aanwezigheid en integriteit van DNA werden in alle monsters geverifieerd door PCR β-globine gen amplificatie met behulp van de primers PC04 en GH20 . De algemene consensus primersets GP5+/GP6+ en MY09/MY11 werden gebruikt om de aanwezigheid van HPV DNA door PCR te analyseren (tabel 1) zoals eerder beschreven. Bovendien werden DNA-monsters die negatief waren voor GP5+/GP6+ of MY09/MY11 PCR opnieuw gemonsterd met behulp van een geneste PCR-benadering met het GP5+/GP6+ primerpaar. PCR-producten van de verwachte grootte (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) werden gezuiverd en direct gesequeneerd met een ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). De sequenties werden uitgelijnd en met behulp van het BLAST-programma vergeleken met die van bekende HPV-typen in de GenBank-database.
p16 immunohistochemie
Immunohistochemie voor p16 werd uitgevoerd met behulp van een CINTec® p16 Histology Kit (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Duitsland) volgens het protocol van de fabrikant. De immunolabeling werd gevisualiseerd door incubatie in 3,3′-diaminobenzidine en de gekleurde objectglaasjes werden tegengekleurd met hematoxyline.
De scoringscriteria voor p16-immunoreactiviteit die in de huidige studie werden gebruikt, waren als volgt: 0, geen kleuring; 1, 1 – < 25% van de tumorcellen positief voor p16; 2, 25 – < 50% positief; 3, 50 – < 75% positief; 4, ≥75% positief en zwakke kleuringintensiteit; en 5, ≥75% positief en ten minste matige kleuringintensiteit. De term “p16-overexpressie” (p16-positief) werd in deze studie gedefinieerd als een score van 5.
ISH met HPV DNA-probes
Biotinyl tyramide-gebaseerde ISH werd uitgevoerd met de GenPoint™ HPV gebiotinyleerde DNA-probe en het GenPoint tyramide signaalversterkingssysteem voor gebiotinyleerde probes volgens het protocol van de fabrikant (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). De GenPoint HPV gebiotinyleerde DNA-probe reageert met HPV-types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, en 68 in 4 μm dikke coupes van FFPE-monsters. Detectie van de gehybridiseerde probe werd uitgevoerd met het GenPoint-detectiesysteem volgens het protocol van de fabrikant, met de bijgeleverde primaire streptavidine-horseradish peroxidase (HRP), biotinyl tyramide, secundaire streptavidine-HRP, en 3,3′-diaminobenzidine l (Dako; Agilent Technologies). De dia’s werden tegengekleurd met hematoxyline.
Bepaling van de virale belasting en de fysieke status van HPV-16 door qPCR
Om de virale belasting en de fysieke status van HPV-16 te evalueren, werd qPCR uitgevoerd zoals eerder beschreven . In het kort werden primers en TaqMan-probes gericht tegen de HPV-16 E2- en E6-open leesramen gebruikt (tabel 1). De primers en probes herkennen het E2-scharniergebied, dat bij HPV-16-integratie wordt verwijderd. Twee standaardcurven voor de E2- en E6-genen werden gecreëerd door amplificatie van 10-voudige seriële verdunningen (101, 102, 103, 104, 105 en 106 virale kopieën) van het pB-actin early plasmide, dat een gift was van Karl Munger, en dat de volledige HPV-16 early genregio bevat (Addgene plasmid # 13711; Addgene, Cambridge, MA). Virale DNA-belasting werd beoordeeld door het E6-kopiegetal te berekenen. Een externe standaard curve werd gemaakt met behulp van bekende seriële verdunningen (0,3, 3, 30, en 300 ng) van humaan genomisch placenta DNA (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) voor cellulaire DNA kwantificering, en β-globine werd geamplificeerd zoals eerder beschreven. De hoeveelheid DNA werd berekend door de Cq-waarden uit te zetten tegen de logaritme van de standaardcurve. De fysieke status van HPV-16 werd beoordeeld op basis van een eerder gepubliceerde methode . Een E2/E6-verhouding ≥ 1 wijst op de overheersing van de episomale vorm, terwijl een verhouding E2-kopiegetal/totaal E6 < 1 wijst op de aanwezigheid van zowel geïntegreerde als episomale vormen (gemengde vorm).
Detectie van E6-mRNA-expressie door qPCR en RNA-ISH bij HPV-16-positieve patiënten met p16-overexpressie
E6-mRNA-expressie werd gedetecteerd in monsters van patiënten die als HPV-16-positief met p16-overexpressie waren geïdentificeerd. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit bevroren weefsels met RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. Totaal RNA (500 ng) werd gebruikt voor de synthese van eerste-strengs cDNA met behulp van een PrimeScript™ RT Reagent Kit met gDNA Eraser (Perfect Real Time; Takara Bio) volgens de instructies van de fabrikant. Om de expressie van HPV-16 E6 mRNA te meten, werd qPCR uitgevoerd met het CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) en TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Er werden primers en TaqMan-probes (tabel 1) gebruikt die gericht zijn tegen het HPV-16 E6-gen en het β-actinegen. De β-actine probe werd gelabeld met FAM aan het 5′-eind en met TAMRA aan het 3′-eind (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan). De amplificatiecondities waren: 2 min. bij 50 °C, 10 min. bij 95 °C, en een 2-staps cyclus van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 60 s voor een totaal van 40 cycli. Twee standaardcurven werden gegenereerd voor de E6- en β-actinegenen door amplificatie van seriële 10-voudige verdunningen (101, 102, 103, 104, 105 en 106 kopieën) van het pB-actine early plasmide en het pCAG-mGFP-actine plasmide, dat een gift was van Ryohei Yasuda, en dat de volledige coderende regio van β-actine bevat (Addgene plasmide # 21948; Addgene). De expressie van het E6-gen in elk monster werd genormaliseerd door de hoeveelheid van de interne controle β-actine.
RNA ISH voor HPV-16/- 18 E6/E7 mRNA werd uitgevoerd met een RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden seriële 4 µm dikke coupes van FFPE monsters gedeparaffineerd in xyleen en gerehydrateerd met behulp van een getrapte alcoholreeks. Endogene peroxidase werd geblokkeerd met het RNAscope® waterstofperoxidereagens bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Target HPV RNA retrieval werd uitgevoerd in RNAscope® Target Retrieval Reagent bij 100 °C gedurende 15 min. De glaasjes werden gedigesteerd met RNAscope® Protease Plus bij 40 °C gedurende 30 min. De HPV-16/- 18 E6/E7 RNA probe (RNAscope® Probe-HPV16/18) werd aan de coupes toegevoegd en er werd een dekglaasje aangebracht. De objectglaasjes werden overgebracht naar een bevochtigde kamer voor hybridisatie bij 40 °C gedurende 2 uur. Daarna werden de dekglaasjes verwijderd en werden de objectglaasjes gewassen met RNAscope® Wash Buffer Reagent bij 40 °C. De signaalversterking werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Detectie van de gehybridiseerde probe werd uitgevoerd met 3,3′-diaminobenzidine (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit). De objectglaasjes werden tegengekleurd met hematoxyline. Positieve controleglaasjes (HeLa-cellen die HPV-18 E6/E7 mRNA tot expressie brengen) werden opgenomen in RNA ISH. Positieve kleuring werd geïdentificeerd als bruine punctate dots gezien in de kern en/of cytoplasma.
Statistische analyse
Pearson’s chi-kwadraat test werd gebruikt om de karakteristieken van LC-patiënten te vergelijken volgens HPV DNA en p16 overexpressie status. Cumulatieve overleving (CS) werd berekend met de Kaplan-Meier methode en werd vergeleken tussen twee groepen met behulp van de log-rank test. Alle analyses werden uitgevoerd met SPSS Statistical Package (SPSS, versie 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 werd als significant beschouwd.