In vitro antimicrobiële gevoeligheid van Aerococcus urinae voor 14 antibiotica, en time-kill curves voor penicilline, gentamicine en vancomycine

Abstract

Aerococcus urinae is een nieuwkomer in de klinische en microbiologische praktijk en veroorzaakt urineweginfecties, bacteriëmie/septikemie en/of endocarditis. Deze studie presenteert voor de eerste keer een evaluatie van de activiteit van een representatief panel van antibiotica tegen een groot aantal A. urinae isolaten. De in vitro gevoeligheden (MIC’s) van 56 isolaten van A. urinae voor 14 antibiotica werden bepaald door agarverdunning. In het algemeen vertoonden A. urinae isolaten weinig inter-isolaat variabiliteit, en hadden ze lage MIC’s voor penicilline, amoxicilline, piperacilline, cefepime, vancomycine en rifampicine. Geen van de isolaten bleek resistent tegen aminoglycosiden op hoog niveau. Matige tot goede activiteit werd waargenomen met quinolonen, erytromycine en tetracycline. Isolaten van twee patiënten met endocarditis werden bestudeerd met time-kill curves voor penicilline, gentamicine en vancomycine. Penicilline en vancomycine alleen vertoonden trage of geen bactericide activiteit tegen de twee stammen. Bij combinatie van penicilline of vancomycine met gentamicine werd een snelle bactericide activiteit verkregen voor beide stammen met beide combinaties. De behandelingsmogelijkheden voor A. urinae lijken penicillines te omvatten voor minder ernstige gevallen. In ernstige gevallen, d.w.z. endocarditis, suggereren de time-kill onderzoeken een gunstig effect van combinatie met gentamicine. Bij de penicilline-allergische patiënt vormt vancomycine in combinatie met gentamicine het meest voor de hand liggende alternatief.

Inleiding

In het afgelopen decennium heeft de klinische relevantie van verschillende katalase-negatieve, Gram-positieve cocci veel aandacht gekregen.1 Aerococcus urinae is een nieuwkomer in de klinische en microbiologische praktijk, voor het eerst gerapporteerd in 19892 en aangewezen in 1992.3A. urinae-isolaten werden oorspronkelijk herkend aan hun celmorfologie (stafylokokken-achtig in Gram-kleuring) en groeikenmerken (lijkend op α-haemolytische streptokokken op bloedagar), een negatieve katalasereactie, en een zeer constant antibiogram dat gevoeligheid voor penicilline en resistentie tegen sulfonamiden en aminoglycosiden aantoont.24 In twee rapporten werden A. urinae-stammen geïsoleerd uit 0,4-0,8% van de onderzochte urinemonsters.2,5 De meeste patiënten bij wie A. urinae werd geïsoleerd, waren bejaard met predisponerende aandoeningen en tekenen van urineweginfectie.2,4,5 Stammen die urineweginfecties veroorzaken, zijn herkend in Denemarken, Zweden, Nederland, Frankrijk, de VS, Canada en Zuid-Amerikaanse landen.6A. urinae is ook geïsoleerd uit bloed van patiënten met urogenetische bacteriëmie/septikemie met of zonder endocarditis.7-11 Een landelijk onderzoek in Denemarken van 1987 tot 1995 identificeerde 26 patiënten met A. urinae geïsoleerd uit bloed,6 wat overeenkomt met 0,5 patiënten/jaar/1 miljoen inwoners, en 0,8% van infectieuze endocarditis-episoden.8 Bacteriëmische/septikemische episoden reageerden goed op behandeling met β-lactamines alleen of in combinatie met een aminoglyco-ide, tenzij de bacteriëmie werd gecompliceerd met endocarditis, in welke gevallen vijf van de zes patiënten overleden. Bij één patiënt kon bij autopsie A. urinae uit de kleppen worden gekweekt, ondanks kennelijk relevante antibiotische behandeling. Daarom moet de optimale behandeling van endocarditis met A. urinae worden bepaald.

Tests van A. urinae-isolaten met behulp van tablet/disc diffusiemethoden hebben gevoeligheid voor een breed scala van antimicrobiële middelen aan het licht gebracht, waaronder zowel β-lactam als niet β-lactam antibiotica.5,6,12 Aangezien A. urinae-isolaten voornamelijk in verband zijn gebracht met infecties van de urinewegen, is het opmerkelijk dat de stammen resistent zijn gebleken tegen sulfonamiden en andere antimicrobiële stoffen die worden gebruikt voor de behandeling van urineweginfecties, waaronder co-trimoxazol, trimethoprim, nalidixinezuur en polymyxinen.2,5,6,12 Recent werd de gevoeligheid van twee A. urinae isolaten van endocarditis patiënten onderzocht met MIC’s van zeven antibiotica, en werden time-kill curves voor penicilline in combinatie met gentamicine of netilmicine uitgevoerd.11 De huidige studie karakteriseert verder het gevoeligheidspatroon van 56 A. urinae isolaten van verschillende geografische origine. MIC’s van 14 antibiotica werden bepaald, en voor twee isolaten werden time-kill curve experimenten met penicilline, gentamicine en vancomycine, alleen of in combinatie, uitgevoerd om meer informatie te verkrijgen over optimale behandelingsschema’s van ernstige infecties veroorzaakt door A. urinae.

Materialen en methoden

Stammen

Zesenveertig epidemiologisch niet-gerelateerde klinische isolaten van A. urinae werden bestudeerd, bestaande uit 42 Deense isolaten (17 bloedisolaten en 25 urine-isolaten) en 14 niet-Deense urine-isolaten: één uit Nederland (vriendelijk ter beschikking gesteld door P. J. G. M. Rietra), vier uit Zweden (vriendelijk ter beschikking gesteld door E. Falsen, Culture Collection, University of Göteborg) en zeven Noord-Amerikaanse isolaten (vriendelijk ter beschikking gesteld door R. R. Facklam, The Streptococcus Laboratory, CDC, Atlanta, GA, USA). De volgende referentiestammen werden gebruikt: Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATTC 25922 en Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Antimicrobiële stoffen

De volgende antimicrobiële stoffen werden gebruikt: benzylpenicilline (Leo, Ballerup, Denemarken); cefepime (Bristol-Myers Squibb, Wallingford, CT, VS); amoxicilline, ceftriaxon, erytromycine, amikacine, gentamicine, netilmicine, rifampicine, vancomycine (Sigma, St Louis, MO, VS); oxytetracycline (Rosco, Taastrup, Denemarken), piperacilline (Lederle, Pearl River, NY, VS), ciprofloxacine (Bayer, Leverkusen, Duitsland); en sparfloxacine (Rhône Poulenc Rorer, Vitry, Frankrijk).

MIC-bepaling

Omwille van de snelle groei van A. urinae moesten de testomstandigheden worden gewijzigd ten opzichte van de standaardaanbevelingen om MIC-bepalingen uit te voeren (d.w.z. 5% bloedtoevoeging van de agar en incubatie in 5% CO2 atmosfeer gedurende 48 uur).13-15 De MIC’s werden bepaald met de agar-verdunningsmethode. Tweevoudige seriële verdunningen van antimicrobiële stoffen werden bereid in Mueller-Hinton agar (Difco Laboratories GmbH, Augsburg, Duitsland), aangevuld met 5% gerysd paardenbloed. Antibiotica werden getest van 0,008 tot 512 mg/L, met uitzondering van amoxicilline (0,032-256 mg/L), rifampicine (0,008-32 mg/L) en oxytetracycline (0,008-2 mg/L). De inocula van 107 kve/mL (104 kve/spot) werden bereid uit agarculturen van één nacht en gesuspendeerd in 0,9% NaCl, en werden toegepast met een 21-punts multiple inoculator (Denley Instruments Ltd, Billinghurst, UK). De resultaten werden afgelezen na incubatie gedurende 2 dagen bij 37°C in 5% CO2. De MIC werd afgelezen als de laagste concentratie die groei van maximaal drie kolonies liet zien.

Time-kill curve onderzoeken

Twee van de geteste bloedisolaten (B1 en B8), beide van patiënten met endocarditis, werden onderzocht. De stammen werden getest tegen penicilline (MIC 0,125 en 0,6 mg/L, respectievelijk), gentamicine (MIC 256 en 64 mg/L, respectievelijk), en vancomycine (MIC 0.5 en 1 mg/L, respectievelijk) in de volgende klinisch bereikbare concentraties: penicilline 2 × en 10 × MIC (P2 en P10, respectievelijk); vancomycine 4 × en 10 × MIC (V4 en V10, respectievelijk); gentamicine 10 mg/L (G10); en de combinaties penicilline + gentamicine en vancomycine + gentamicine in de volgende concentraties: P2G10, P10G10, V4G10 en V10G10, respectievelijk. Om t = -1 uur werden verse, ’s nachts gekweekte kolonies gesuspendeerd tot c. 105 kve/ml in buisjes met voorverwarmde Todd-Hewitt-bouillon. De buisjes werden in een waterbad bij 37°C geplaatst. Om t = 0 uur werden antibiotica, die onmiddellijk voor de bepaling waren bereid, in tweevoud aan de buisjes toegevoegd. Drie buisjes zonder antibiotica werden gebruikt als groeicontrole. Van elk buisje werden op 0, 3, 6 en 24 uur monsters in duplo genomen. De monsters werden in serie verdund en uitgezet. Het aantal overlevende kolonies werd geteld na een nacht incubatie bij 37°C in omgevingslucht in plastic zakken samen met nat vloeipapier. Met monsters van 20 μL was het minimaal telbare aantal bacteriën 50 kve/mL. Het carry-over effect werd geëlimineerd voor de penicilline-gentamicine experimenten door toevoeging van 100 μl 100 000 U/mL penicillinase aan elke plaat. Voor de vancomycine-gentamicine-experimenten werd carry-over-effect geëlimineerd door verdunning. Een proefonderzoek toonde carry-over effect aan in het monster 100 maar niet in het monster 10-1, kve werden daarom geteld met gebruikmaking van 200 μL van de monsters 10-1, wat nog steeds een detectiegrens van 50 kve/mL geeft. Alle experimenten werden ten minste tweemaal op verschillende dagen uitgevoerd. Bactericideactiviteit werd gedefinieerd als een reductie van het inoculum met ten minste 99,9% binnen 24 uur. Synergie (S), additief effect (A) en antagonisme werden gedefinieerd als: >2 log meer doden (S), >1 en <2 log meer doden (A) en >2 log verminderde doden, respectievelijk, voor de combinatie in vergelijking met de beste van de individuele antibiotica.

Resultaten

MIC-bepaling

De MIC’s verkregen voor de 56 isolaten zijn weergegeven in de tabel. Gebruikmakend van de breekpunten voor streptokokken aanbevolen door de NCCLS14,15 of door de Zweedse referentiegroep voor antibiotica (SRGA),16,17 waren de isolaten gevoelig voor de penicillines, terwijl verminderde gevoeligheid werd gevonden voor de geteste cefalosporines. De MIC’s voor de aminoglycosiden wezen op verminderde gevoeligheid voor bijna alle isolaten. Resistentie tegen aminoglycosiden op hoog niveau (d.w.z. gentamicine > 1000 mg/L) werd echter voor geen van de isolaten gevonden. Alle isolaten waren gevoelig voor vancomycine. Rifampicine was het meest actieve geteste geneesmiddel met een MIC50 van 0,031 mg/L (range <0,004-0,064 mg/L), behalve voor één isolaat met een MIC > 32 mg/L (herhaalde testen). De activiteiten van de chinolonen ciprofloxacin en sparfloxacin bleken even goed te zijn.

Killing curve onderzoeken

Gemiddelde time-kill curves voor elk experiment worden gepresenteerd in de figuur. Vancomycine alleen (zowel 4 × als 10 × MIC) vertoonde bactericide activiteit tegen stam B1. Voor penicilline werd alleen bactericide activiteit gevonden voor 10 × MIC tegen B8. Voor beide antibiotica was het bactericide-effect traag, d.w.z. dat het pas na 24 uur optrad. Gentamicine was niet bactericide – in de meeste experimenten werd groei waargenomen. Penicilline in combinatie met gentamicine was synergetisch en was snel bactericide voor stam B8 in zowel P2G10 als P10G10. Voor stam B1 werd echter alleen een additief en traag bactericide effect gevonden. Bij combinatie van vancomycine met gentamicine werd een snel bactericide effect gevonden voor beide stammen. Een synergetisch effect was aantoonbaar na 3 uur en 6 uur voor stam B8. Na 24 uur was de dodende activiteit van vancomycine echter zo uitgesproken dat het niet mogelijk was een synergetisch effect te detecteren. Voor B1 werd alleen een additief effect gevonden. In geen van de experimenten werden antagonistische effecten geregistreerd.

Discussie

Deze studie presenteert voor het eerst een evaluatie van de MIC’s van een representatief panel van antibiotica tegen een groot aantal A. urinae isolaten verkregen van patiënten met urineweginfectie, bacteriëmie/septikemie en/of endocarditis. Om het gebruik van antibiogrammen voor taxonomische doeleinden te evalueren, zijn MIC’s van 15 antibiotica voor 10 A. urinae stammen eerder onderzocht,12 maar er zijn geen gedetailleerde gegevens gepresenteerd.

A. urinae zijn kieskeurige organismen die suppletie van bloed in de media vereisen en soms incubatie in een met CO2 verrijkte atmosfeer en/of een verlengde incubatieperiode om voldoende groei te verkrijgen voor het testen van de gevoeligheid voor antibiotica. Daarom konden de stammen niet worden getest onder de standaardomstandigheden zoals beschreven door de BSAC of NCCLS.13-15 De noodzaak om de kweekomstandigheden aan te passen is echter een veel voorkomend probleem voor fastidious Grampositieve bacteriën.18,19A. urinae-isolaten vertoonden een antimicrobieel gevoeligheidspatroon dat vergelijkbaar is met dat van α-haemo-lytische streptokokken, met slechts kleine inter-isolaatgevoeligheidsvariaties. De MIC’s van β-lactammen voor de isolaten lagen meestal binnen vier verdunningsstappen van een factor twee, behalve voor de cefalosporines ceftriaxon en cefepime, die een grotere variatie in MIC vertoonden (tabel). Vanwege de mogelijke invloed van CO2 incubatie (verlaging van de pH), is voorzichtigheid geboden bij het beoordelen van de gevoeligheid voor tetracycline (overschatte gevoeligheid) en erytromycine (onderschatte gevoeligheid). Onder de onderzochte A. urinae isolaten werd geen hoge resistentie vastgesteld tegen de geteste aminoglycosiden, wat de mogelijkheid openlaat van een synergetisch effect wanneer gecombineerd met een β-lactam of vancomycine (vide infra). Zoals beoordeeld op basis van de MIC’s bestaan er verschillende behandelingsalternatieven voor ernstige infecties, aangezien de isolaten gevoelig waren voor penicillines, vancomycine en rifampicine (behalve één isolaat). De geselecteerde chinolonen, ciprofloxacine en sparfloxacine, vertoonden ook een goede activiteit. Hoewel het een kieskeurig organisme is, waren de resultaten verkregen met disc diffusie methoden2,5,20 in overeenstemming met de MIC’s gepresenteerd in deze studie, wat suggereert dat een betrouwbaar resultaat kan worden verkregen met behulp van deze routine vatbaarheidsmethoden.

Richtlijnen voor de behandeling van ernstige infecties zoals septikemie met of zonder endocarditis zouden optimaal gebaseerd moeten zijn op klinische ervaring in zorgvuldig opgezette studies, maar dit is moeilijk wanneer het gaat om zeldzame bacteriën. Daarom kunnen in vitro studies met inbegrip van killing curve-technieken in deze gevallen belangrijke informatie voor de clinicus opleveren.

Voor de experimenten werden antibioticaconcentraties gekozen die in vivo haalbaar zijn. Voor gentamicine werd een dosis van 10 mg/L gekozen, wat overeenkomt met de concentratie die wordt verkregen bij een eenmaal daagse dosering van 240 mg (overeenkomend met 3-4 mg/kg).21 Bovendien wordt, hoewel in verschillende artikelen een tweemaal daagse dosering voor endocarditis wordt aanbevolen, in Denemarken gewoonlijk eenmaal daagse gentamicine gebruikt, vanwege de vermindering van nefrotoxiciteit en het feit dat het synergetische effect met β-lactam antibiotica toeneemt met toenemende aminoglycoside concentraties.22 De gegevens verkregen in onze in vitro studie van de dodende curven voor penicilline en vancomycine toonden aan dat noch penicilline noch vancomycine bactericide was tegen één van de twee geteste isolaten van patiënten met infectieuze endocarditis. In combinatie met gentamicine werd een bactericide effect verkregen tegen beide isolaten voor zowel penicilline als vancomycine. Gelukkig worden deze schema’s wereldwijd aanbevolen voor de behandeling van infectieuze endocarditis van onbekende etiologie.23 De dodingssnelheden van de twee stammen waren verschillend, wat erop wijst dat er variaties tussen de stammen kunnen bestaan. Ondanks in vitro gevoeligheid voor de gegeven antibiotica vonden wij dat de prognose slecht was voor oudere patiënten die leden aan infectieuze endocarditis veroorzaakt door A. urinae.8 De huidige resultaten voor penicilline, gentamicine en netilmicine (MIC) zijn in overeenstemming met die in het recente Zwitserse rapport van Zbinden et al.11 voor twee A. urinae isolaten van endocarditis patiënten.

De behandelingsopties voor A. urinae lijken penicillines voor minder ernstige gevallen te omvatten. In ernstige gevallen, d.w.z. endocarditis, suggereren de time-kill onderzoeken een voordeel van het combineren van penicilline of vancomycine met gentamicine. Bij de penicilline-allergische patiënt is vancomycine het meest voor de hand liggende alternatief.