APL biedt al sinds 1998 native gel-analysediensten aan. Vandaag de dag negeren veel laboratoria helaas dit waardevolle hulpmiddel omdat ze denken dat natieve gels gewoon te moeilijk zijn om te gebruiken, of omdat ze ten onrechte denken dat ze alleen kunnen worden gebruikt met zure eiwitten. Bij Alliance Protein Laboratories voeren we routinematig natieve gels uit op zowel basische als zure eiwitten. We zouden graag monsters voor u uitvoeren en/of met u samenwerken om een protocol te ontwikkelen voor gebruik in uw lab.
Wat is een natieve gel?
“Native” of “niet-denaturerende” gelelektroforese wordt uitgevoerd in de afwezigheid van SDS. Terwijl bij SDS-PAGE de elektroforetische beweeglijkheid van eiwitten voornamelijk afhangt van hun moleculaire massa, hangt bij native PAGE de beweeglijkheid af van zowel de lading van het eiwit als zijn hydrodynamische grootte.
De elektrische lading die de elektroforese aandrijft, wordt bepaald door de intrinsieke lading van het eiwit bij de pH van de lopende buffer. Deze lading is natuurlijk afhankelijk van de aminozuursamenstelling van het eiwit en post-translationele modificaties zoals toevoeging van siaalzuren.
Omdat het eiwit zijn gevouwen conformatie behoudt, zal de hydrodynamische grootte en mobiliteit op de gel ook variëren met de aard van deze conformatie (hogere mobiliteit voor meer compacte conformatie, lagere voor grotere structuren zoals oligomeren). Als natieve PAGE wordt uitgevoerd in de buurt van neutrale pH om zure of basische denaturatie te vermijden, dan kan het worden gebruikt om conformatie, zelf-associatie of aggregatie, en de binding van andere eiwitten of verbindingen te bestuderen.
Dus natieve gels kunnen gevoelig zijn voor elk proces dat ofwel de lading of de conformatie van een eiwit wijzigt. Dit maakt ze uitstekende hulpmiddelen voor het detecteren van dingen zoals:
-
veranderingen in lading als gevolg van chemische degradatie (bijv. deamidatie)
-
ongevouwen, “gesmolten globule”, of andere gewijzigde conformatie
-
oligomeren en aggregaten (zowel covalent als niet-covalent)
-
bindingsgebeurtenissen (eiwit-eiwit of eiwit-ligand)
Deze eigenschappen, en hun relatief hoge verwerkingscapaciteit maken natieve gels tot uitstekende hulpmiddelen voor het analyseren van versnelde stabiliteitsmonsters, het aantonen van de vergelijkbaarheid van verschillende partijen of processen, of het onderzoeken van de effecten van excipientia.
Een ander voordeel van natieve gels is dat het mogelijk is om eiwitten na de scheiding in hun natieve staat terug te krijgen. Het is echter mogelijk dat het terugwinnen van actief biologisch materiaal moet plaatsvinden voordat fixatie of kleuring heeft plaatsgevonden.
Merk op dat de natieve gels die hier worden besproken, nu soms “clear native” gels worden genoemd. Zij verschillen in principe van de zogenaamde “blue native” gels, die afhankelijk zijn van de binding van kleurstof om het eiwit een zeer hoge elektrische lading te geven, die de intrinsieke lading van het polypeptide overweldigt. Als wordt aangenomen dat de hoeveelheid gebonden kleurstof evenredig is met de massa van het eiwit, kan de mobiliteit die met dit “blue native” protocol wordt waargenomen, worden gebruikt om de molaire massa te schatten door vergelijking met eiwitstandaarden, net zoals dat bij SDS-PAGE gebeurt. De massastandaarden die worden verkocht voor gebruik met blauwe natieve gels kunnen niet worden gebruikt om molaire massa’s te schatten voor de echte natieve gels die hier worden besproken.