De waarneming dat immunoneutralisatie van somatostatine het basale volume en de amylase-output verhoogde in een geïsoleerd rattenpancreas-model, suggereert een intrapancreatische bron van somatostatine. Dit pancreas-somatostatine zou derhalve een tonische remming van de exocriene pancreassecretie kunnen veroorzaken (97). Bij ratten bij bewustzijn met gal en pancreassecreties teruggevoerd naar de darm, remde iv somatostatine (5 µg kg-1 h-1) de basale pancreas proteïne en vloeistof secretie met 84 en 64%, respectievelijk; toevoeging van atropine ip (500 µg kg-1 h-1) veroorzaakte geen verdere remming (51). Bij onder narcose gebrachte ratten werd de basale secretie van amylase aanzienlijk geremd door een infusie van somatostatine in een relatief hoge dosis van 100 µg 100 g-1 h-1. Wanneer het echter werd toegediend als een bolusinjectie van 50 µg 100 g-1 BW, verviervoudigde de amylase-afgifte gedurende 20 min (39). In een eerdere studie (25) resulteerde somatostatine, toegediend in doses van 0,4 tot 25 µg kg-1 h-1 aan fistelratten bij bewustzijn, in dosisafhankelijke verlagingen van de basale flow, bicarbonaat- en eiwitafgifte. Bij de hoogste doses verminderde de eiwitafgifte met 80%, het bicarbonaat met 63% en de doorstroming met 42%. Bij urethaan verdoofde ratten werd een aanvankelijke toename van alle pancreasparameters waargenomen in de eerste twee minuten, gevolgd door een afname van de eiwitafgifte met 30 tot 40%. In dergelijke omstandigheden moest somatostatine de dosis van 100 µg kg-1 h-1 bereiken om de basale bicarbonaatafgifte te beïnvloeden. Deze gegevens over de basale pancreas secretie van vocht en eiwitten geven aan dat het remmende effect van somatostatine soortspecifiek lijkt en gevoelig voor anesthesie, zoals eerder aangetoond (17). Wanneer ratten intraduodenaal SS-14 toegediend kregen in doses van 12 tot 96 µg kg-1 h-1, werden het totale basale volume en de eiwitafgifte niet beïnvloed; deze resultaten zouden erop kunnen wijzen dat luminaal duodenaal somatostatine de basale pancreassecretie niet rechtstreeks beïnvloedt of via de basale afgifte van CCK en secretine (126). In tegenstelling tot de rat, remde de iv infusie van SS-28 met 400 ng kg-1 h-1 de basale vloeistof- en eiwitsecretie volledig bij de bij bewustzijn zijnde hond (147). Ook bij honden, voorbereid met maag- en pancreasfistels, remde somatostatine-14 met 2,5 µg kg-1 h-1 de basale volume- en eiwitproductie met meer dan 90% (146).
Bij de mens werd de prikkeling van de alvleesklier door intraduodenale toediening van tryptofaan of een mengsel van aminozuren verzwakt door exogeen SS-28 (58). In andere studies bij de mens remde octreotide de postprandiale afscheiding van pancreas-enzymen (81). Bij de hond veroorzaakte SS-14, toegediend als iv bolus van 3,5 µg kg-1 gevolgd door een infusie van 3,5 µg kg-1 h-1, een aanzienlijke verlaging van de duodenale activiteiten van trypsine en amylase tijdens een stimulatie van een testmaaltijd (70). Bij de rat remde octreotide significant het pancreasvolume, bicarbonaat, amylase en serumspiegels van secretine en CCK in reactie op intraduodenaal oliezuur, een CCK releaser (137).
In gezonde vrijwilligers (30) werd zuiver pancreassap verkregen door endoscopische cannulatie van de hoofdklier van de pancreas. Als reactie op synthetische secretine (0,06 VE kg-1 h-1) bereikte de bicarbonaatconcentratie in pancreassap na 10 min een niveau van 117 µEq ml-1 en een sapstroom van 7,3 ml/5 min na 15 min secretine-infusie. SS-14 leidde tot een afname van de pancreasstroom met 47% na 10 min en met 67% na 15 min. De bicarbonaat- en eiwitconcentraties in het pancreassap vertoonden slechts een tendens tot daling bij de somatostatinedosis van 5 µg kg-1 h-1. Ook bij mensen werd de secretie van pancreasenzymen, maar niet van bicarbonaat, gestimuleerd door secretine (250 ng kg-1/20 min) en caeruleïne (25 ng kg-1/20 min), op een dosisonafhankelijke wijze geremd door SMS 201-995 (73). Bij honden bij bewustzijn (147) werd de secretie van vocht en bicarbonaat, gestimuleerd door secretine (1 VE kg-1 h-1), licht beïnvloed door grotere doses SS-28 (400 ng kg-1 h-1). Bij dezelfde dosis werd de eiwitproductie, gestimuleerd door caeruleïne, aanzienlijk geremd. Bij verdoofde ratten veroorzaakte lineaire somatostatine-14 toegediend aan 100 µg/100 g-1 h-1 een sterke remming van de pancreas amylase en trypsine afgifte gestimuleerd door 3 IVY dog units/100 g-1 h-1 van CCK met een snelle opleving van deze afscheidingen zodra de somatostatine infusie werd beëindigd (39). Bij ratten bij bewustzijn met een omleiding van het pancreassap (51), die een sterke toename van de eiwit- en vochtafscheiding veroorzaakte, remden alle vijf doses van toegediend octreotide (5,20,80,320 en 1280 ng kg-1 h-1) zowel de eiwit- als de vochtafscheiding aanzienlijk met IC50 van respectievelijk 40 en 60 ng kg-1 h-1. De maximale remming van eiwit en vocht bereikte respectievelijk 90% en 75% bij een dosis van 1,28 µg kg-1 h-1. In vergelijking met zijn analoog octreotide had SS-14 een IC50 van 0,7 µg kg-1 h-1 voor eiwitafscheiding en 1,2 µg kg-1 h-1 voor vloeistofafscheiding, met een maximaal remmend effect verkregen bij 25 µg kg-1 h-1 voor zowel eiwitafscheiding als vloeistofafscheiding. Deze gegevens wijzen erop dat octreotide 20 maal krachtiger is dan SS-14 in het remmen van pancreas proteïne en volume secretie gestimuleerd door pancreassap omleiding.
In vitro studies
Pancreas enzym en vloeistof secretie in vivo is de som van talrijke complexe fysiologische processen die het samenspel van endocriene en paracriene hormonen en neurotransmitter stimulatie en afgifte bevatten. Door deze meervoudige interacties is het vaak moeilijk te beoordelen of een stof die de secretie van de pancreas in vivo remt, rechtstreeks de acinaire en ductale celfuncties beïnvloedt of de vrijstelling van secretagogen verandert. Daarom kunnen de geïsoleerde geperfundeerde pancreas, de geïsoleerde acinaire en ductale celpreparaten en celculturen van beide celtypen antwoorden op sommige van deze vragen geven.
Pancreatische acinare cellen van ratten bezitten receptoren die specifiek zijn voor somatostatine-14 en 28 (124,166), die ook na de celpreparaten aanwezig blijven (40). Ook is gerapporteerd dat in de geïsoleerde geperfundeerde alvleesklier van de hond tot 50-80% van de geperfundeerde somatostatine kan opnemen in een concentratiebereik van 20 tot 4000 pg ml-1, vergeleken met minder dan 21% van insuline of glucagon (71). Deze waarneming werd later bevestigd met een extractie van SS-14 door de in situ pancreas van de hond van gemiddeld meer dan 50% vergeleken met minder dan 17% voor glucagon (152). Al deze waarnemingen laten ons geloven dat somatostatine in staat zou moeten zijn om direct neuraal of hormonaal gestimuleerde afscheiding van pancreas-enzymen in vitro te remmen, gebruik makend van de hierboven genoemde celpreparaten.
Ondanks vele studies is het remmende effect van SS-14 en SS-28 op gestimuleerde afscheiding van enzymen uit geïsoleerde pancreas-acini nog steeds controversieel. Om sommige van deze tegengestelde resultaten te begrijpen, kan het helpen een onderscheid te maken tussen het effect van SS op stimulatie waarbij de agonist, zoals VIP, werkt via cAMP, waarbij de SS remt en agonisten zoals CCK waarbij sommige onderzoekers een remmend effect waarnamen en anderen niet. In geperfundeerde cavia-acini werd het kinetische profiel van amylase-afgifte als reactie op VIP aanzienlijk verlaagd door SS (100 nM) (140). Anderzijds remde octreotide (100 nM) aanzienlijk de synergetische amylase-afgifte gestimuleerd door secretine + CCK-8 of door VIP + CCK-8 (65). Somatostatine remde ook het effect van cAMP op de calcium-geïnduceerde amylase-afscheiding van pancreasacini van ratten door de dosis-responscurve naar rechts te verschuiven (99), nog een voorbeeld van SS dat via de cAMP-route werkt.
Vele andere studies tonen echter duidelijk aan dat somatostatine geen remmende effecten heeft op de exocriene pancreas in vitro, of het nu gaat om de geïsoleerde geperfundeerde pancreas, de geïsoleerde acini of de geïsoleerde lobule preparaten waarin CCK de stimulus was (65,96,99,139,158). In geïsoleerde rattenpancreas (43) versterkte exogene insuline (10 mU ml-1) de CCK en carbachol gestimuleerde amylase secretie aanzienlijk, een versterking die aanzienlijk werd geremd door SS. Het ontbreken van een direct remmend effect van SS werd ook waargenomen in geïsoleerde pariëtale cellen van de hond (106). SS bij 1 µM remde inderdaad niet de maagsecretorische respons op histamine, methacholine en pentagastrine, hetgeen enkele van de bovengenoemde gegevens ondersteunt. Interessant is dat SS-28 in de hoge concentratie van 10 µM in staat was de amylase-afgifte uit pancreasacini van cavia’s te stimuleren tot ongeveer 68% van die welke gestimuleerd werd door 100 pM caeruleïne. Een maximale secretorische respons identiek aan die geïnitieerd door caeruleïne werd ook verkregen door twee SS-28-analogen, Nat S1-28 en SS28. Onder deze omstandigheden had SS-14 geen stimulerend effect (33). Als verklaring voor dit secretorische effect van SS-28 op acini werd voorgesteld dat SS-28 bij hoge concentraties kan interageren met de CCK-receptor (34), een effect dat wordt geremd door DBcGMP, een CCK-receptorantagonist (105). Anderzijds kan het falen van SS-14 om de gestimuleerde enzymafscheiding van geïsoleerde acini te remmen het gevolg zijn van het vrijkomen in het incubatiemedium van een actief protease, voor het eerst waargenomen in het afgescheiden pancreassap, dat in staat is SS-14 af te breken (127). Dit serine protease werd tot homogeniteit gezuiverd uit zuiver pancreassap van ratten. Met een MW van ongeveer 29 kDa komt het overeen met het rattenpancreatische elastase II. Als het in het incubatiemedium wordt uitgescheiden, zou het dus SS-14 afbreken en de remmende werking ervan voorkomen, wat gedeeltelijk verklaart waarom SS-14 in vitro geen remmende werking op de afgifte van enzymen kon uitoefenen (151). Het kan ook de secretorische respons op SS-28 bij lagere concentraties in het incubatiemedium beïnvloeden. Een andere mogelijkheid zou kunnen zijn dat calciummobiliserende stoffen de affiniteit van de somatostatine-receptoren van de acinecellen voor somatostatine verminderen (33).
Effecten op de groei
Normale groei van een organisme is het resultaat van een complex evenwicht van de betrokken hormonen, zoals groeihormoon, insuline en schildklierhormonen. Aangezien somatostatine de afgifte van een groot aantal hormonen kan remmen, zou de neutralisatie ervan de secretie ervan moeten stimuleren en dus de groei doen toenemen. Deze benadering van auto-immunisatie tegen somatostatine om de groei te stimuleren is getest bij lammeren. Wanneer significante antilichaamtiters werden verkregen, was de gewichtstoename van de geïmmuniseerde SS-dieren groter en ging zij gepaard met een toename van de lichaamslengte. Bij deze geïmmuniseerde lammeren was er een grotere groeihormoonrespons op arginine-stimulatie en waren de basale bloedspiegels van somatomedine hoger (143). Deze gegevens werden later ook bij deze diersoort bevestigd (75). Wanneer somatostatine toegediend werd aan ratten die onderhuids geïmplanteerd waren met een Alzet minipomp, had toediening van 1,5 µg h-1 gedurende 14 dagen geen effect op hun gewichtstoename. De infusie van een somatostatine-antagonist leidde echter tot een significante toename van de gewichtstoename ten opzichte van de controle (144).
Bij de rat had de dagelijkse injectie van somatostatine-14 à 390 µg kg-1 dag-1 in gelatine gedurende drie weken geen effect op het lichaamsgewicht, maar verlaagde de pariëtale en peptische celdichtheid per kubieke millimeter in vergelijking met de controles. Het antagoneerde echter het groeibevorderende effect van exogene (130 µg kg-1 dag-1) en endogene gastrine-afgifte na transpositie van het antrum op het colon, wat hypergastrinemie veroorzaakte. Bij deze antrum-transpositie dieren werd het toegenomen pancreasgewicht significant verminderd door somatostatine (400 µg kg-1 dag-1) gedurende 3 weken (80). Gedurende een periode van 5 dagen veroorzaakte somatostatine-14 s.c. in gelatine in doses van 11, 33 of 100 µg kg-1 om de 8 uur significante dalingen van pancreas amylase, chymotrypsine en eiwitconcentraties en het totale DNA-gehalte alleen bij de twee hoogste doses zonder enig effect op het totale pancreasgewicht. De snelheid van de synthese van eiwit, RNA en DNA werd echter onmiddellijk na elke somatostatine-injectie gedurende 24 uur aanzienlijk verlaagd (92). Somatostatine-14, ook toegediend s.c. in gelatine in een dosis van 600 µg kg-1, driemaal per dag gedurende 2 en 4 dagen, verminderde de trofische effecten van caeruleïne (1 µg kg-1, driemaal per dag) aanzienlijk, met een sterk effect op het totale DNA-gehalte. Interessant is dat immunoneutralisatie tegen SS-14 alle bestudeerde groeiparameters aanzienlijk deed toenemen boven die welke werden waargenomen in reactie op caeruleïne (93). Vergelijkbare remmende effecten werden waargenomen bij langdurige toediening van langwerkend somatostatine, SMS 201-995 (54). Omleiding van het pancreassap bij de rat veroorzaakt een aanzienlijke afgifte van endogeen CCK, hetgeen leidt tot een verhoogde groei van de pancreas (89). Gebruikmakend van deze procedure van gal-pancreatisch sap omleiding, leidde een dergelijke techniek toegepast 8 uur per dag-1 gedurende 4 dagen tot een significante toename van het pancreasgewicht en serum CCK; beide effecten werden significant verminderd door SMS 201-995 toegediend in een dosis van 5 µg kg-1 h-1 en door L-364,718, een CCK-1 receptor antagonist, toegediend in een dosis van 0,5 mg kg-1 h-1. Onder deze omstandigheden waren zowel SMS als L-364,718 equipotent in het verminderen van de groei van de pancreas, terwijl SMS de enige antagonist was die in staat was om het endogene CCK, vrijgemaakt door pancreas-bile diversie, tot een basaal niveau te reduceren (119). Deze gegevens wijzen erop dat somatostatine en analogen de groei van de pancreas, gestimuleerd door exogeen en endogeen vrijgemaakte CCK, kunnen verminderen. Tenslotte werd waargenomen dat somatostatine (SMS), toegediend met een dosis van 5 µg kg-1 h-1 gedurende 2 dagen, in staat was om een door 70% caseïne geïnduceerde toename van het pancreasgewicht en het totale RNA- en DNA-gehalte volledig te voorkomen (94). Dit is een ander bewijs dat somatostatine de geïnduceerde groei van de alvleesklier kan controleren, gestimuleerd door endogene CCK die vrijkomt bij een dieet dat rijk is aan proteïnen (50). SMS 201-995, alleen toegediend als een iv infusie gedurende 7 dagen in een dosis van 5 µg kg-1 h-1, veroorzaakte een significante afname van het pancreas- en darmgewicht, gepaard gaande met een afname van het totale DNA en RNA in beide organen. Plasma CCK en IGF-1 werden verlaagd, terwijl het totale pancreas IGF-1 gehalte verhoogd werd (120). Naast endogene CCK suggereren enkele waarnemingen de mogelijke betrokkenheid van IGF-1 in het proces van positieve groeiregeling in de darm en de pancreas. Deze groeifactor is inderdaad aanwezig in de darm (28) en de pancreas (56) en specifieke receptoren werden gedocumenteerd op cellen van deze organen (76,162); paracriene of autocriene werkingsmechanismen werden gepostuleerd (29). Somatostatine kan op de controle van deze twee organen inwerken door een remming van de IGF-1-afgifte die gepaard gaat met een soortgelijk effect op de intestinale CCK.
Effecten van Somatostatine op pancreastumoren
Somatostatine is gekarakteriseerd als de “universele uit-schakelaar” omdat het de meeste orgaan- en celfuncties remt waarmee het in verband is gebracht. Een rol voor somatostatine en zijn analogen bij de behandeling van pancreaskanker is gesuggereerd omdat deze moleculen aanvankelijk een positieve niet-toxische adjuvante therapie boden.
In de Gouden Syrische hamster, subcutaan geïmplanteerd met WD ductale pancreasadenocarcinoma cellen, verminderde een 21-daagse chronische behandeling met het somatostatine analoog (L-5-Br-Trp8)SS in een dosis van 20 µg b.i.d., het tumorgewicht met 44% en het tumorvolume met 22% (114). Van somatostatine en zijn analoog RC-160 is ook aangetoond dat zij preneoplastische veranderingen afremmen en de incidentie van tumoren verminderen bij hamsters die zijn blootgesteld aan het pancreaskankerverwekkende middel BOP; deze behandelingen veroorzaakten een toename van het aantal apoptotische tumorcellen (150). In een andere studie nam het aantal somatostatinereceptoren op de tumorcellen toe na behandeling met RC-160 (35). De groei van MIAPaCa-2 cellen die s.c. in naakte muizen werden geïmplanteerd, werd dosis-afhankelijk geremd door tweemaal daagse injecties met octreotide van 250 en 2500 µg kg-1 (160). Met behulp van een andere wijze van toediening van het geneesmiddel, microcapsules, remde RC-160 toegediend aan 1250 µg kg-1 d-1 aanzienlijk de groei van de MIAPaCa-2 tumoren in naakte muizen (110). Het falen van somatostatine of zijn analogen om de tumorgroei te remmen zou het gevolg kunnen zijn van de afwezigheid van een SS-receptor zoals aangetoond in de humane pancreaskankercellen PGER die niet reageren op SMS 201-995 (141). In MIAPaCa-2 en PANC-1 cellen, gekweekt in DMEM met 10% foetaal kalfsserum, remden 1 µM SS-14 en SMS 201-995 de groei van de PANC-1 cellen met activering van het tyrosine fosfatase SHP-1. Daarentegen veroorzaakten SS en zijn analoog de groei van de MIAPaCa-2 cel en dit groei-effect zou het gevolg kunnen zijn van de afwezigheid van SHP-1 in deze cellen (31). In cellen die op somatostatine reageren, is eerder aangetoond dat SHP-1 samen met de somatostatinereceptor gepurificeerd is (167). Een soortgelijk groeistimulerend effect van SMS werd waargenomen in BON-cellen (humane pancreascarcinoïde cellen) bij doses van 1 nM en 100 nM; dit groei-effect ging gepaard met significante verlagingen van het cAMP-gehalte van de cellen zonder dat dit van invloed was op de PIhydrolyse (66).
De meeste klinische proeven met somatostatine-analogen bij de adjuvante behandeling van pancreaskanker hebben geen respons aangetoond. Bij 14 patiënten met gemetastaseerde alvleesklierkanker werd geen antitumor effect waargenomen met drie dagelijkse s.c. injecties van 100-200 µg SMS gedurende 7 weken (72). In een andere studie kregen negentien patiënten met gevorderd exocrien pancreascarcinoom gedurende 2 maanden het somatostatine-analoog BIM23014 van 250 µg tot 1 mg dag-1 toegediend. Binnen deze groep had één patiënt een partiële respons, 6 patiënten hadden stabiele ziekte, en elf patiënten hadden progressieve ziekte (20). Uit studies uitgevoerd op verschillende alvleesklierkankercellen en de verschillende verkregen reacties op hun groei, lijkt het erop dat een sleutel tot succes in de kritische strijd tegen alvleesklierkanker de expressie van specifieke somatostatinereceptoren en het gebruik van het specifieke analoog is (37). De eigenschappen van de vijf gekloonde subtypes van menselijke somatostatinereceptoren en de vastgestelde, waarschijnlijke en onbevestigde indicaties voor het gebruik van somatostatine-analogen zijn samengevat in referentie 77.
Clinisch gebruik van somatostatine
Clinisch is octreotide gebruikt bij de behandeling van acute pancreatitis, maar er werd geen unaniem voordeel bevestigd. In één studie (111) werd somatostatine gegeven in een initiële bolusdosis van 250 µg gevolgd door 250 µg h-1 als continue infusie; de behandeling bij 9 van de 12 patiënten met acute pancreatitis keerde de amylasemie en bracht klinische verbetering, maar liet geen vermindering van het sterftecijfer zien. Somatostatine blijft echter een doeltreffende behandeling voor gevestigde lokale complicaties van acute pancreatitis, zoals pancreasfistels en pseudocysten (112). In één studie werden patiënten met gemetastaseerde pancreatische endocriene tumoren aanvankelijk behandeld met 50 µg octreotide s.c. om de 12 uur en later (6-16 maanden) werd de dosis verhoogd tot 500 µg om de 8 uur. Sommige patiënten reageerden niet op de behandeling, terwijl deze bij anderen wel effectief was; de symptomen verbeterden, maar kwamen uiteindelijk toch weer terug en alle patiënten stierven zodra de resistentie-fase van hun ziekte was bereikt (163). Deze gegevens wijzen erop dat somatostatine niet de ideale behandeling is voor pancreatitis, maar nuttig kan zijn voor de behandeling van plaatselijke complicaties van de ziekte. SMS heeft echter aangetoond zeer efficiënt te zijn in het elimineren van pancreatische diarree en het mogelijk maken van correctie van dehydratie en acidose. Het effect ervan resulteerde in de duidelijke vermindering van de plasmaconcentraties van VIP (84).
3. Hulpmiddelen voor de studie van somatostatine
a) Peptide
Somatostatine-14 en -28 zijn in de handel verkrijgbaar. De belangrijkste in vivo gebruikte agonist is octreotide (SMS 201-995) en de andere zijn: RC-160, BIM-23014, BIM-23056, BIM-23027 en L-362.855. Van de BIM-reeks werkt BIM-23056 als een agonist op de SST-3-receptor en als een antagonist op de SST-5-receptor (161). De chemische structuren van deze moleculen zijn weergegeven in tabel 1.
b) Antilichamen en assays
Antilichamen tegen somatostatine -14, -28, SMS 201-995 en RC-160 zijn in vele laboratoria ontwikkeld. Als voorbeeld heeft Guillemin een RIA opgezet met gebruikmaking van een schapenantiserum BARBAR-78; dit antiserum werd opgewekt tegen synthetisch SS-14 en het kruisreageert met synthetisch ovien SS-28 in equimolaire verhouding (15). Er is ook een specifiek antiserum tegen SS-28 ontwikkeld (67) en er zijn ook RIA’s voor SMS 201-995 (5) en RC-160 (83) vastgesteld.
c) Experimentele modellen
De meeste fysiologische studies die bij mensen zijn uitgevoerd, zijn gedaan bij mannelijke en vrouwelijke gezonde vrijwilligers (30). Bij de proefdieren werden de meeste studies uitgevoerd bij bewuste honden met maag- en pancreasfistels (146,147), bij bewuste ratten met omgeleid gal-pancreatisch sap (25,127) en bij verdoofde ratten (39). Voor het chronische effect van somatostatine op de pancreas werden ratten dagelijks behandeld met s.c. injecties met somatostatine (92). In vitro studies werden gewoonlijk uitgevoerd met vers geprepareerde pancreasacini, geïsoleerde kwabben of geïsoleerde geperfundeerde pancreas van ratten, muizen of cavia’s (65, 96,139,158). In tabel 2 worden enkele gegevens gepresenteerd over gebruikte diersoorten, gegeven doses of concentraties somatostatine en analogen en effecten.