COMMENTARY
De kleurstofuitsluiting is een eenvoudige en snelle techniek om de levensvatbaarheid van cellen te meten, maar daarbij doet zich het probleem voor dat de levensvatbaarheid indirect wordt bepaald aan de hand van de integriteit van het celmembraan. Het is dus mogelijk dat de levensvatbaarheid van een cel is aangetast (gemeten aan de hand van de groei- of functiecapaciteit), ook al is de integriteit van het celmembraan (althans tijdelijk) gehandhaafd. Omgekeerd is het mogelijk dat de integriteit van het celmembraan abnormaal is, maar dat de cel in staat is zichzelf te herstellen en volledig levensvatbaar te worden. Een ander potentieel probleem is dat, omdat de kleurstofopname subjectief wordt beoordeeld, kleine hoeveelheden kleurstofopname die op celbeschadiging wijzen onopgemerkt kunnen blijven. In dit verband resulteert kleurstofexclusie, uitgevoerd met een fluorescerende kleurstof met een fluorescentiemicroscoop, routinematig in de score van meer niet-levensvatbare cellen met kleurstofopname dan tests die worden uitgevoerd met trypanblauw met een transmissiemicroscoop.
Een meer verfijnde methode om de levensvatbaarheid van cellen te meten is het bepalen van kleurstofexclusie door middel van flowcytometrie. Dit kan worden gedaan met typan blauw, aangezien dit eiwit zich bindt aan eiwitten en vervolgens een fluorescentiesignaal uitzendt dat in een flowcytometer kan worden gedetecteerd (bij 660 nm wanneer gebonden aan boviene serumalbumine) (zie referentie 2 voor details over het gebruik van trypan blauw in flowcytometrie). Als alternatief kan de uitsluiting worden gemeten met andere lichtgevende kleurstoffen zoals propidiumjodide (zie eenheid 5.4 voor een beschrijving van het gebruik van propridiumjodide evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen door middel van flowcytometrische analyse). Uit een gedetailleerde vergelijking van de schattingen van levende versus dode cellen met behulp van trypanblauwe exclusie, handmatig geëvalueerd zoals hier beschreven, en elektronisch geëvalueerd met behulp van flowcytometrie blijkt dat de twee technieken in ervaren handen zeer vergelijkbare resultaten opleveren. Terwijl bij de beschreven kleurstofexclusietechniek de kans op fouten door subjectiviteit van de operator groter is, is de flowcytometrische aanpak minder geschikt voor evaluatie van de levensvatbaarheid van de cellen tijdens de uitvoering van complexe en tijdrovende celzuiveringstechnieken. Een flowcytometrische techniek is dus alleen toepasbaar wanneer nauwkeurige metingen van het aantal dode cellen in een celmengsel moeten worden verkregen.
Recentelijk is een “geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop levensvatbaarheidstest” gerapporteerd waarbij de levensvatbaarheid van cellen wordt bepaald met behulp van propidiumjodide in combinatie met een apparaat dat levende en dode cellen telt in een draagbare microscoop celteller die is uitgerust met een microchip. Deze teller zou in staat zijn de levensvatbaarheid van de cellen sneller te beoordelen dan de hier beschreven manuele techniek of de flowcytometer en nauwkeurigere en betrouwbaardere tellingen te verkrijgen. Dit apparaat kan nuttig zijn in situaties waarin veel snel verkregen bepalingen van de levensvatbaarheid van cellen nodig zijn (3).
Opgemerkt zij dat de levensvatbaarheid van cellen ook kan worden beoordeeld met kleurstoffen die zich binden aan DNA (ethidiummonoazide), middelen die zich binden aan fosfatidylserine (Annexine V) en amine reactieve kleurstoffen. Het gebruik van deze alternatieve middelen vereist gewoonlijk flowcytometrie en is daarom alleen onder bijzondere omstandigheden toepasbaar.
Trypanlue exclusion, zoals beschreven in bovenstaand protocol, kan in 5 tot 10 min.
worden uitgevoerd.