Case presentation
De huidige case report is afgeleid van een routine veterinair bezoek aan een 155 dieren tellende boerderij, met twee schapenrassen (Pelifolk en Blackbelly), gelegen in Tesistán, gemeente Zapopan, staat van Jalisco, Mexico. De voorzieningen van dit bedrijf waren aangepast van een vorig varkensbedrijf, en zijn nog steeds omringd door varkens- en rundveehouderijen in de nabije omgeving. De kudde werd op verhoogde vloeren gehouden om het reinigen en hanteren te vergemakkelijken, maar er waren veel geroosterde scherpe voorwerpen (zoals ijzerdraad, gebroken hekken, spijkers, enz.) in de hokken aanwezig en op het moment van de inspectie werd er niet naar behoren gereinigd op de boerderij. Het voeder was gebaseerd op plaatselijk beschikbaar voer, zoals ruwvoer van lage kwaliteit, varkensmest-silage en commercieel krachtvoer met een hoog eiwitgehalte. Dit bedrijf deed een beroep op de veterinaire diensten omdat bij de dieren regelmatig abcessen in de huid werden aangetroffen; er werden geen andere klachten in verband met huidproblemen gemeld. Abcessen lijken de produktiviteit van de dieren niet te beïnvloeden, maar de aanwezigheid van dergelijke laesies heeft een negatieve invloed op de afzet van de dieren, en daarom was de eigenaar geïnteresseerd in de etiologische oorzaak en de aanbevolen behandeling om de ziekte op het bedrijf te elimineren. De inhoud van de abcessen werd bij 31 dieren (29 ooien, 1 ram en 1 lam) door een gecertificeerde dierenarts bemonsterd en naar het laboratorium gestuurd voor bacteriologische diagnose, om de etiologische agentia te vinden die het probleem veroorzaakten. Op basis van het uiterlijk van de abcessen was de vermoedelijke diagnose voor de infectie op het bedrijf voor de meeste dieren Caseuze lymfadenitis. Uit bacteriologisch onderzoek bleek echter dat 13 dieren besmet waren met C. pseudotuberculosis, 1 met Corynebacterium spp., 2 met Proteus spp., 2 met Streptococcus spp., en in de overige 13 gevallen kon de ziekteverwekker niet worden geïdentificeerd. De categorisatie voor het Corynebacterium spp. isolaat was onduidelijk omdat de resultaten van de bacteriologische en biochemische testen niet concluderend waren.
Dit artikel beschrijft de isolatie van C. xerosis uit een 4 maanden oud Pelifolk (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) lam in goede lichaamsconditie. Voor zover bekend is dit de eerste melding van C. xerosis die een klinisch cutaan abces veroorzaakt bij schapen. Van de eigenaar van het dier werd geïnformeerde toestemming verkregen voor de publicatie van de resultaten van de klinische studie, inclusief fotomateriaal. Het dier vertoonde een abces met een harde consistentie, zonder drainage, aan de linkerkant van de hals (Fig. 1a). De eerste klinische diagnose suggereerde caseuze lymfadenitis, mogelijk veroorzaakt door C.pseudotuberculosis. Een monster voor bacteriologische analyse werd verkregen door het abces aan te prikken met een steriele, 5 ml injectiespuit, met een 20 gauge hypodermische naald na het schoonmaken en desinfecteren van het oppervlak van het abces. Het soort exsudaat dat werd verkregen was sereus en zag er wit uit. Het biologische monster werd bewaard bij 4 °C tot de biologische karakterisering in het Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15,5 Toluca-Atlacomulco weg, Toluca, Mexico, z.c. 50200). De tijd tussen de bemonstering en de verwerking bedroeg niet meer dan 72 uur. Het monster werd in duplo gekweekt in 8 % schapenbloedagar en 24-48 uur bij 37 °C geïncubeerd in aerobe en microaerofiele omstandigheden. Er werden kolonies waargenomen met een diameter van 1,0 mm, niet-hemolytisch, geelachtig-bruin van kleur en enigszins droog van uiterlijk (Fig. 2a). Deze morfologische kenmerken kwamen niet overeen met die welke eerder voor C. pseudotuberculosis waren beschreven, maar leken eerder kolonies van C. xerosis . Microscopisch (10× vergroting; Fig. 2c) werden de bacteriën waargenomen als knotsachtig geëindigde, pleomorfe, onregelmatig gekleurde Gram-positieve staafjes. Biochemische tests toonden de volgende resultaten: Triple sugar Iron (TSI,-), Lysine Iron agar (LIA,-), Citraat test (CIT,-), Sulphide Indole-Motility (SIM,-), Motility, Indole, Ornitine (MIO,-), Oxidative-fermentative (OF,-) Methyl red (-), Peptonwater (-), Voger Pascaguer (-), Ureum (-), Nitraatbouillon (+), Trehalose (+), Sucrose (+), Maltose (+) en Glucosefermentatie (positief bij 37 °C en negatief bij 42 °C). Deze resultaten zouden kunnen overeenkomen met een C. pseudotuberculosis-profiel, met uitzondering van de ureumtest, die negatief was in plaats van positief, en daarom beter samenvalt met een C. xerosis-profiel . De diagnostische resultaten waren niet doorslaggevend, daarom besloten we, ook al is het API-systeem niet specifiek om C. xerosis te identificeren, het isolaat met dit systeem te bestuderen, om te zien of dit isolaat als andere Corynebacterium-soorten kon worden geïdentificeerd. Om te achterhalen of dit isolaat behoort tot andere soorten zoals C. freneyi en C. amycolatum die zelden bij schapen worden aangetroffen, hebben we getest of de kolonie kon groeien bij 20 °C en of ze glucose kon fermenteren bij 42 °C. Het isolaat groeide goed bij 20 °C en fermenteerde geen glucose bij 42 °C, beide kenmerken die geassocieerd worden met C. xerosis en C. hansenii , daarom besloten we een moleculaire analyse uit te voeren om na te gaan of we het isolaat moleculair konden identificeren als C. xerosis. We analyseerden drie loci om onze diagnostische nauwkeurigheid te vergroten. We hebben getest op een gen dat normaal afwezig is in C. xerosis maar wel in C. pseudotuberculosis, het pld gen, waarvan we verwachtten geen amplicon te vinden na de PCR test als het isolaat C. xerosis was in tegenstelling tot C. pseudotuberculosis, dat een 203 bp band zal amplificeren; een tweede locus was gericht op de amplificatie van de intergene spacer-regio van de 16S-23S rRNA-genen (16S-23S), met gebruikmaking van primers die zijn ontworpen voor C. pseudotuberculosis, waarvan bekend is dat ze niet werken voor C. xerosis , en we zouden ook geen amplificatieband verwachten voor C. xerosis en een 816 bp band voor C. pseudotuberculosis. Tenslotte hebben wij PCR-amplificatie en sequencing uitgevoerd van het rpoB-gen (446 bp), waarvan eerder is gemeld dat het onderscheid maakt tussen soorten Corynebacterium . De DNA-extractie werd uitgevoerd met een commerciële kit (KAPA Express Extract) volgens het protocol van de fabrikant. Een multiplex-PCR-techniek voor amplificatie van partiële sequenties van de pld-, 16S-23S- en rpoB-genen werd uitgevoerd volgens het door Pacheco in 2007 gepubliceerde protocol. De reacties werden uitgevoerd met een commerciële multiplex PCR-kit (QIAGEN Multiplex PCR) volgens de specificaties van de fabrikant. De PCR-analyse omvatte de volgende monsters: Het te karakteriseren isolaat, het vermeende C. xerosis isolaat, en twee C. pseudotuberculosis (een lokaal isolaat eerder gekarakteriseerd als biovar ovis en, een referentiestam, ATCC 43924, biovar equi) gebruikt als controles. Zoals verwacht voor de vermoedelijke C. xerosis werd een enkele PCR-ampliconband van 446 bp, die overeenkomt met het rpoB-genfragment, geamplificeerd, en werden de intergene 16S-23S-gen- en pld-genfragmenten niet geamplificeerd. Ook zoals verwacht vertoonden beide C. pseudotuberculosis-stammen drie banden van 203, 446 en 816 bp, die overeenkomen met respectievelijk de genen pld, rpoB en 16S (fig. 3). De rpoB-genamplicons van de drie monsters werden gezuiverd met de Promega purification kit (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) en voor automatische sequentiebepaling verzonden naar Macrogen (Rockville, MD, USA). Meervoudige sequentie-uitlijningen verkregen uit een BLAST (NCBI) werden samen met onze isolaatsequenties geanalyseerd met behulp van Clustal W-analyse van Mega 6.0.6 (Fig. 4). Fylogenetische analyse werd uitgevoerd met behulp van de neighbor-joining methode (MEGA software 6.0.6). Bootstrap waarden werden verkregen door het genereren van 1000 willekeurige bomen. De fylogenetische analyse omvatte ook de sequenties van het rpoB-gen van C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1) en C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2). Het was mogelijk verschillende fylogenetische groepen waar te nemen die overeenkwamen met bepaalde soorten Corynebacterium. Deze resultaten, bevestigen dat het isolaat van deze studie (rpoB C53) C. xerosis is (Fig. 4).
Gestudeerd abces. Een abces met een harde consistentie zonder drainage werd gemeld in het halsgebied van een lam van 4 maanden oud
In-vitro Bacteriologische kweek van Corynebacterium xerosis en Corynebacterium pseudotuberculosis. De bacteriën werden gekweekt in 8% schapenbloedagar. aCorynebacterium pseudotuberculosis (ATCC 43924) vertoonde witachtige kolonies met beta-hemolyse. bCorynebacterium xerosis-isolaat, groeide als kleine geelbruine kolonies zonder hemolyse. c Gram-gekleurd uitstrijkpreparaat van Corynebacterium xerosis met karakteristieke pleomorfe Gram-positieve staafjes, met knotsachtige uiteinden
Multiplex PCR. Amplificatie van partiële sequenties van 16S rRNA-, rpoB- en pld-genen. MW-rijstrook: molecuulgewichtmarker van 1 Kb Plus DNA Ladder™ (Invitrogen). Rij 1: negatieve controle (reactie zonder sjabloon-DNA). Rij 2: Corynebacterium pseudotuberculosis biovar equi. Banen 3-4: Corynebacterium xerosis-isolaat (10-0,001 ng DNA, respectievelijk). Rij 5: Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis
Bioinformatische analyse. a Geeft de sequentie-uitlijning weer van de sequenties die zijn gebruikt om de fylogenetische boom in (b) te construeren. Drie sequenties werden gedownload uit GenBank: C. pseudotuberculosis biovar ovis (CP002924.1), C. pseudotuberculosis biovar equi (CP003540.2), en Corynebacterium xerosis (AY492233.1). De andere drie waren monsters die voor sequentiebepaling werden opgestuurd (Macrogen, Rockville, MD, USA): rpoB13 (plaatselijk isolaat gekarakteriseerd als C. pseudotuberculosis, biovar ovis), rpoB C1 (C. pseudotuberculosis, biovar equi, referentiestam ATCC43924) en rpoB C53 (lokaal isolaat, gekarakteriseerd als C. xerosis). b De boom toont de genetische verwantschap van Corynebacterium pseudotuberculosis en Corynebcaterium xerosis voor het rpoB-gen. De boom werd gebouwd op basis van de uitlijning van de partiële sequentie van het gen. Bootstrap-waarden werden verkregen door 1000 willekeurige bomen te genereren, en de sterkte van elke tak is aangegeven in de respectieve knoop
Genotyperingstechnieken zoals PCR en sequentieanalyse van het rpoB C53 isolaat in deze studie hebben in hoge mate bijgedragen tot een correcte soortidentificatie, die oorspronkelijk misleidend was wanneer gebruik werd gemaakt van fenotypische microscopische en biochemische kenmerken. Corynebacterium xerosis is eerder gemeld in klinische monsters van menselijke gevallen in laesies bij endocarditis, pneumonitis, osteomyelitis en huidinfecties, vooral bij immuungecompromitteerde patiënten . Het is ook aangetroffen in klinische monsters van dieren, bijvoorbeeld in leverlaesies van geiten (vermoedelijk pseudotuberculose), en koemelk, van dieren met mastitis. Bij varkens is C. xerosis geïsoleerd uit laesies in verschillende weefsels, zoals lever, nieren, longen, milt, gewrichten, alsook uit onderhuids abces. Bovendien is C. xerosis geïsoleerd uit klinische monsters van de baarmoeder van schapen, in een geval van abortus, en uit longweefsel van dieren die ademhalingsproblemen vertoonden. Deze isolaten werden geïdentificeerd en gekarakteriseerd door amplificatie van het rRNA 16S-23S gen met behulp van PCR-RFLP. In deze studies was het echter niet mogelijk een bandpatroon te verkrijgen dat duidelijk genoeg was om C. xerosis te onderscheiden van andere soorten Corynebacterium. De auteurs voerden ook een analyse en sequentievergelijking uit van de genen 16S en rpoB, waardoor zij C. xerosis konden onderscheiden van andere soorten die genetisch vergelijkbaar zijn met Corynebacterium.
Zoals hierboven vermeld, werd deze studie uitgevoerd op basis van de aanwezigheid van het rpoB gen, dat door andere auteurs is gerapporteerd als het gen bij uitstek voor fylogenetische analyse van het genus Corynebacterium, omdat het een hoog polymorfisme vertoont, zelfs groter dan de intergene spacer regio van de 16S-23S rRNA genen . Het is bekend dat cutane abcessen bij schapen (caseuze lymfadenitis) worden veroorzaakt door C. pseudotuberculosis en de belangrijkste virulentie- en pathogeniteitsfactor is het exotoxine fosfolipase D, dat wordt gecodeerd door het pld-gen en tot expressie komt in het celmembraan van de bacterie. Dit exotoxine is een permeabiliteitsfactor die de hydrolyse van de esterbindingen in sfingomyeline in celmembranen van zoogdieren bevordert, en mogelijk bijdraagt tot de verspreiding van de bacterie van de eerste infectieplaats naar secundaire plaatsen via het lymfestelsel naar regionale ganglia, en het lijkt betrokken te zijn bij de vermindering van de levensvatbaarheid van macrofagen na infectie . Het exotoxine veroorzaakt ook dermonecrotische laesies. Dit exotoxine is echter nog niet gerapporteerd bij C. xerosis als een pathogeen toxine dat zou kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van abcessen. Dit onderstreept het belang van verder onderzoek naar de infectiemechanismen die bij deze Corynebacterium-soort aanwezig zijn.
Een belangrijk discussiepunt van epidemiologische aard is onder meer het feit dat het productiesysteem voor schapen, waar het monster vandaan kwam, voorheen werd gebruikt voor varkens, een diersoort waar C. xerosis is gerapporteerd als een veelvoorkomende ziekteverwekker . Bovendien bevat een van de hoofdingrediënten van het schapenvoer bijproducten van varkens (varkensmest-mest), die uiteindelijk actieve ziekteverwekkers kunnen bevatten, waaronder misschien Corynebacterium spp. Bovendien zijn scherpe voorwerpen zoals metalen staven, spijkers en draden overal in de installaties te vinden, waardoor de kans op verwonding van de dieren toeneemt, waardoor Corynebacterium spp. in het organisme, waaronder C. xerosis, terecht kan komen. Al deze factoren kunnen hebben bijgedragen tot de aanwezigheid van C. xerosis in de inrichting. Er werd geen verder onderzoek verricht, maar de eigenaar werd aanbevolen abcessen van alle dieren te verwijderen en te ontsmetten, in een infectievrije ruimte (om verspreiding van de ziekteverwekkers te voorkomen), de hokken te reinigen en alle scherpe randen en voorwerpen van de omheiningen, voederbakken en vloeren te verwijderen. Aangezien C. xerosis, evenals C. pseudotuberculosis, potentieel zoönotische micro-organismen zijn, werd de veehouder aanbevolen extreme voorzorgsmaatregelen te nemen bij het hanteren van dieren en afval van het bedrijf om besmetting van mens en dier en de mogelijke verspreiding van het micro-organisme naar andere bedrijven te voorkomen.