Een van de methoden om PD’s te voorkomen bestaat uit fysisch-chemische optimalisatie van het PCR-systeem, d.w.z. wijziging van de concentraties van primers, magnesiumchloride, nucleotiden, ionensterkte en temperatuur van de reactie. Deze methode is enigszins beperkt door de fysisch-chemische kenmerken die mede bepalend zijn voor de efficiëntie van de amplificatie van de doelsequentie in de PCR. Daarom kan een vermindering van de PD-vorming ook resulteren in een verminderde PCR-efficiëntie. Om deze beperking te ondervangen zijn er andere methoden die alleen op vermindering van de vorming van PD’s zijn gericht, waaronder primerontwerp en gebruik van verschillende PCR-enzymsystemen of reagentia.
Software voor het ontwerpen van primersEdit
Programmatuur voor het ontwerpen van primers maakt gebruik van algoritmen die controleren op de mogelijkheid van secundaire structuurvorming van DNA en annealing van primers aan zichzelf of binnen primerparen. Fysische parameters waarmee de software rekening houdt, zijn potentiële zelfcomplementariteit en GC-gehalte van de primers; vergelijkbare smelttemperaturen van de primers; en afwezigheid van secundaire structuren, zoals stamlussen, in de DNA-doelsequentie.
Hot-start PCREdit
Omdat primers zo zijn ontworpen dat ze een lage complementariteit ten opzichte van elkaar hebben, mogen ze alleen annealiseren (stap I in de figuur) bij lage temperatuur, bijv. kamertemperatuur, zoals tijdens de bereiding van het reactiemengsel. Hoewel DNA-polymerasen die in PCR worden gebruikt het actiefst zijn rond 70 °C, hebben zij ook bij lagere temperaturen enige polymerisatieactiviteit, waardoor DNA-synthese uit primers kan ontstaan na annealing aan elkaar. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de vorming van PD’s te voorkomen totdat de reactie de werktemperatuur (60-70 °C) bereikt, en deze omvatten initiële remming van de DNA-polymerase, of fysieke scheiding van reactiecomponenten reactie totdat het reactiemengsel de hogere temperaturen bereikt. Deze methoden worden aangeduid als hot-start PCR.
Wax: bij deze methode wordt het enzym ruimtelijk van het reactiemengsel gescheiden door was die smelt wanneer de reactie een hoge temperatuur bereikt.
Langzame afgifte van magnesium: DNA-polymerase heeft magnesiumionen nodig voor activiteit, dus het magnesium wordt chemisch gescheiden van de reactie door binding aan een chemische verbinding, en komt pas bij hoge temperatuur vrij in de oplossing
Niet-covalente binding van inhibitor: bij deze methode wordt een peptide, antilichaam of aptameer bij lage temperatuur niet-covalent aan het enzym gebonden en remt het de activiteit van het enzym. Na een incubatie van 1-5 minuten bij 95 °C komt de remmer vrij en start de reactie.
Koude-gevoelig Taq-polymerase: is een gemodificeerd DNA-polymerase met vrijwel geen activiteit bij lage temperatuur.
Chemische modificatie: bij deze methode wordt een kleine molecule covalent gebonden aan de zijketen van een aminozuur in de actieve site van het DNA-polymerase. De kleine molecule wordt uit het enzym vrijgemaakt door incubatie van het reactiemengsel gedurende 10-15 minuten bij 95 °C. Zodra de kleine molecule is vrijgekomen, wordt het enzym geactiveerd.
Structurele modificaties van primersEdit
Een andere aanpak om PD-vorming te voorkomen of te verminderen is door de primers zodanig te modificeren dat annealing met zichzelf of elkaar geen extensie veroorzaakt.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): aan het 5′-uiteinde van de primer wordt een nucleotidenstaart toegevoegd, die complementair is aan het 3′-uiteinde van de primer. Door de nabijheid van de 5′-staart anneerslaat deze aan het 3′-uiteinde van de primer. Het resultaat is een steel-loop primer die annealing met kortere overlappingen uitsluit, maar annealing van de primer aan zijn volledig complementaire sequentie in het doelwit mogelijk maakt.
Chimerische primers: sommige DNA-basen in de primer worden vervangen door RNA-basen, waardoor een chimerische sequentie ontstaat. De smelttemperatuur van een chimerische sequentie met een andere chimerische sequentie is lager dan die van een chimerische sequentie met DNA. Dit verschil maakt het mogelijk de annealingtemperatuur zodanig in te stellen dat de primer aan zijn doelsequentie annealiseert, maar niet aan andere chimere primers.
Blokkeerbare primers: een methode die bekend staat als RNase H-afhankelijke PCR (rhPCR), maakt gebruik van een thermostabiel RNase HII om bij hoge temperatuur een blokkerende groep uit de PCR-primers te verwijderen. Dit RNase HII-enzym vertoont vrijwel geen activiteit bij lage temperatuur, zodat de verwijdering van de blokkering alleen bij hoge temperatuur kan plaatsvinden. Het enzym bezit ook inherente primer:template mismatch-discriminatie, wat resulteert in extra selectie tegen primer-dimers.
Voorkomen van signaalverwerving door primer-dimersEdit
Terwijl de bovenstaande methoden zijn ontworpen om PD-vorming te verminderen, is een andere aanpak gericht op het minimaliseren van signaal dat wordt gegenereerd door PD’s in kwantitatieve PCR. Deze aanpak is bruikbaar zolang er weinig PD’s worden gevormd en hun remmende effect op de productaccumulatie gering is.
Vierstaps-PCR: wordt gebruikt bij het werken met niet-specifieke kleurstoffen, zoals SYBR Green I. Zij is gebaseerd op de verschillende lengte, en dus verschillende smelttemperatuur van de PD’s en de doelsequentie. Bij deze methode wordt het signaal verkregen onder de smelttemperatuur van de doelsequentie, maar boven de smelttemperatuur van de PD’s.
Sequentie-specifieke probes: TaqMan- en molecular beacon-probes genereren alleen signaal in aanwezigheid van hun (complementaire) doelsequentie, en deze verhoogde specificiteit sluit signaalacquisitie (maar niet eventuele remmende effecten op de productaccumulatie) door PD’s uit.