Tips en trucs voor gerichte mutagenese

Gerichte mutagenese (SDM) is een techniek die wordt gebruikt om een of meer basen binnen een plasmide te muteren. Deze aanpak kan de aminozuursamenstelling veranderen, bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren vernietigen of fusie-eiwitten creëren – om maar een paar voorbeelden te noemen.

Hoewel SDM het meest wordt gebruikt om de structuur en biologische activiteit van nucleïnezuren en eiwitten te onderzoeken, is het ook nuttig voor het introduceren of verwijderen van herkenningsplaatsen voor restrictie-enzymen om het klonen te vergemakkelijken.

Verder kan SDM een nuttig hulpmiddel zijn voor codon-optimalisatie om zeldzame codons in expressievectoren te vervangen om de efficiëntie van de expressie van heterologe eiwitten te verbeteren. Dit is soms nodig vanwege codon bias, een fenomeen waarbij organismen een voorkeur hebben voor bepaalde codons boven andere, afhankelijk van de beschikbaarheid van tRNA’s in de cel. U kunt hier meer lezen over codongebruik en codon bias.

Wanneer SDM wordt gebruikt om de coderende sequentie te veranderen, creëert het specifieke mutant constructen die kritische residuen of eiwitdomeinen missen die betrokken zijn bij post-translationele modificaties of regulering van eiwitstabiliteit. Het verwijderen van kritische residuen of gebieden in uw plasmiden, zoals fosforyleringsplaatsen of kritische domeinen, biedt een manier om het belang van bepaalde eiwitkenmerken aan te tonen. Bijvoorbeeld, het wijzigen van fosforylatie sites, zoals serine aan un-reactieve alanine of aan fosfomimetics zoals asparaginezuur, levert betrouwbaar bewijs voor site-specifieke eiwit fosforylering. Het maakt de studie van in vitro implicaties van dergelijke post-translationele modificaties.

Traditionele benaderingen van Site-Directed Mutagenesis

Inverse PCR

Voor deleties of inserties van >50 bp, inverse PCR is de meest populaire aanpak. Inverse PCR maakt gebruik van back-to-back primers om het hele plasmide te amplificeren, gevolgd door ligatie van het lineaire product tot circulair DNA. Deze techniek is ook geschikt voor grotere inserties of deleties, b.v. het verwijderen van een regulerend domein uit een eiwit.

Voor deleties kan het geselecteerde gebied worden verwijderd door primers te ontwerpen die annealiseren aan weerszijden van de beoogde deletiezone. Amplificatie gaat van dit gebied naar buiten toe, waardoor deze regio van het PCR-product wordt uitgesloten. Zodra het lineaire product geligeerd is, zal uw nieuwe constructie dit deletiedomein missen. Dit proces wordt schematisch weergegeven in figuur 1 hieronder.

Figuur 1. Protocol voor inverse PCR in SDM.

Inserties kunnen worden bereikt door overlappende primers te gebruiken met flankerende sequenties die de juiste extra basen bevatten. Voor meer informatie over inverse PCR kunt u deze bronnen raadplegen:

• Ochman et al. (1998) Genetic Applications of an Inverse Polymerase Chain Reaction. Genetica. 120:621-623.
• Clifford N. Dominy and David W. Andrews. Site-Directed Mutagenesis by Inverse PCR.

SDM Using Modified Primers

Deze techniek maakt gebruik van gemodificeerde primers om kleine basenpaarveranderingen in een plasmide aan te brengen, en is de methode bij uitstek voor plaatsspecifieke mutaties. Om te beginnen moet je een aantal primers ontwerpen. Maar voor je begint:

• Print een kopie van een aminozuurcodonentabel
• Houd je plasmide- of eiwitsequentie bij de hand.
• Zorg ervoor dat je weet waar het startcodon is en in welk leeskader je sequentie wordt gelezen.

Primerontwerp

Streef naar SDM-primers van ongeveer 30 bp lengte met uw gemuteerde plaats zo dicht mogelijk bij het midden. Hoewel het acceptabel is om primers naar behoefte iets langer of korter te maken, moet er minimaal 12 bp aan weerszijden van je gemuteerde site zijn.

Als je hulp nodig hebt bij het ontwerpen van primers, http://molbiol-tools.ca/PCR.htm somt een aantal zeer nuttige bronnen op om je op weg te helpen.

Kies de juiste reagentia

Ordinaire Taq-polymerase is gewoon niet genoeg als het op SDM aankomt – je moet een proofreading enzym gebruiken. Er zijn diverse commercieel verkrijgbare polymerasekits die de klus kunnen klaren, met een reeks kenmerken zoals high fidelity (proofreading-mogelijkheid) en hot start-activering. Een mogelijkheid is Takara’s In-Fusion HD Cloning Plus – een alles-in-één oplossing die een high-fidelity polymerase, een PCR-zuiveringskit, klonenzym, en competente cellen voor site-directed mutagenesis omvat.

Bedenk dat, zoals de meeste laboratoriumreagentia, veel polymerasen hun eigen voor- en nadelen hebben – over het algemeen zullen laboratoria historische redenen hebben om de een boven de ander te verkiezen en zelden van deze te wijken. Hoewel het verstandig is om vast te houden aan wat werkt, kan het geen kwaad om de literatuur op andere beschikbare bronnen te lezen om er zeker van te zijn dat u de beste reagentia voor de klus hebt!

PCR-reactie

De gebruikte PCR-condities zullen variëren afhankelijk van uw keuze van kit en polymerase, evenals de primers die u hebt ontworpen en de grootte van het product. Het onderstaande voorbeeld is echter een goed uitgangspunt.

Stap	Temp (°C)	Tijd (s)	Cycles
Denature	94	15	18
Anneal	60	30	18
Extension	72	20/kb plasmid	18

Tabel 1: Voorbeeld van SDM thermische cycli programma

Het houden van het aantal cycli laag zal voorkomen dat ongewenste mutaties optreden. Achttien cycli moeten een redelijke hoeveelheid gemuteerd product opleveren zonder ongewenste mutaties op te nemen. Merk op dat het aantal cycli tijdens het oplossen van problemen indien nodig kan worden gewijzigd.

Digest It!

Nu je je PCR-product klaar hebt, moet je de cruciale stap niet vergeten – de digestie! Hier verteer je het ouderlijke sjabloon-DNA om er zeker van te zijn dat je alleen het gemuteerde plasmide voor bacteriële transformatie hebt. Standaardprotocollen vereisen een incubatie van 1 uur bij 37°C met endonuclease Dpn1 om al het damgemethyleerde en hemi-gemethyleerde ouder-DNA te verteren, zodat je je gewenste gemuteerde plasmide overhoudt.

Transformeer en Sequence

Transformeer uw plasmide in competente cellen net zoals u zou doen met elke andere expressie plasmide, en isoleer enkele kolonies voor plasmide isolatie.

Nu moet u een klein volume van uw gewenste plasmide hebben. Voordat u begint met experimenteren, stuur een monster voor sequencing om de aanwezigheid van uw gewenste modificatie (s) te bevestigen. Het is net zo belangrijk om de afwezigheid van secundaire ongewenste mutaties te verzekeren.

Als de sequencing met een positief resultaat terugkomt – gefeliciteerd, u bent een SDM pro! Maar als de sequencing een negatief resultaat oplevert, geen zorgen! U kunt het altijd opnieuw proberen – onze deskundige tips voor het oplossen van problemen met SDM moeten u weer op de goede weg helpen!

Heden ten dage betekenen de dalende kosten van oligonucleotidesynthese en de vooruitgang in de synthetische biologie dat synthetische benaderingen het winnen van plaatsgerichte mutagenese. Bovendien heeft de opkomst van de CRISPR/Cas9-technologie ook de genbewerking vereenvoudigd, zodat mutagenese nu in vitro en in vivo in een paar eenvoudige stappen kan worden uitgevoerd. Niettemin blijft SDM een steunpilaar in de moleculaire biologie toolbox, en gaat niet snel ergens heen.

Orspronkelijk gepubliceerd in 2016. Bijgewerkt en opnieuw gepubliceerd in 2018.