Proteina gigantică Titin

Gelurile proteice standard cu un conținut de acrilamidă cuprins între 6% și 15% au fost utilizate în mod obișnuit pentru a detecta benzi proteice în intervalul 10- până la 200-kD. Deoarece această metodă exclude detectarea proteinelor mai mari, abia în urmă cu două decenii cercetătorii au descoperit o nouă proteină gigantică cu o mobilitate aparentă extrem de scăzută, folosind geluri neconvenționale de 2%. Masa moleculară a acestei noi proteine, titina1 (denumită și connectin2 ), a fost estimată anterior ca fiind cuprinsă între 1,2 și 3,0 MD (pentru recenzii, a se vedea referințele 3 și 4). Atunci când intensitatea benzilor de titină pe gelurile SDS este comparată cu cea a altor proteine miofibrilare, se pare că titina este, după miozină și actină, a treia cea mai abundentă proteină musculară, constituind ≈10% din conținutul combinat de proteine musculare. Astfel, un adult uman cu o greutate corporală de 80 kg poate conține aproximativ o jumătate de kilogram de titină. Având în vedere abundența sa, descoperirea târzie a titinei este destul de surprinzătoare.

În cursul anilor 1980, studiile de microscopie electronică cu anticorpi specifici pentru titină au demonstrat că titina este o parte integrantă a miofibrilei. S-a demonstrat că moleculele unice de titină se întind de la discul Z până la linia M, formând astfel un al treilea sistem de filamente sarcomerice, în afară de filamentele groase (în mare parte miozină) și subțiri (în mare parte actină).5 În consecință, s-a constatat că moleculele native purificate de titină vizualizate prin microscopie electronică au o lungime de >1 μm.6 Mai mult, aceste molecule au apărut ca o tijă cu o substructură în formă de mărgele,6 deoarece lanțurile lor peptidice sunt compuse în principal din repetări de tip Ig și FN3,7 care se pliază în domenii globulare și reprezintă aproape 90% din masa titinei (Fig. 1). În banda A, aceste repetări sunt dispuse în modele foarte bine ordonate și contribuie la organizarea structurii filamentului gros prin furnizarea de situsuri de legare regulat distanțate pentru alte proteine din banda A, în special meromiozina ușoară și proteina C (pentru o analiză, a se vedea referința 15). Datorită unei asocieri strânse cu proteinele din filamentul gros, porțiunea de bandă A a titinei este rigidă din punct de vedere funcțional în condiții fiziologice. În schimb, secțiunea de bandă I a titinei este elastică.517 Atunci când filamentele de titină sunt extrase din sarcomeră sau degradate de radiații sau proteaze, rigiditatea miofibrilei relaxate scade (pentru recenzii, a se vedea Referințele 3 și 4). Mai recent, s-a demonstrat că titina suportă cea mai mare parte a tensiunii de repaus în timpul extensiilor fiziologice, atât în mușchiul scheletic, cât și în cel cardiac.1819

Abordările la nivel molecular pentru investigarea rolului titinei în structura și elasticitatea musculară au devenit mai ușoare după determinarea secvenței ADNc a titinelor scheletice și cardiace umane.8 Așa cum s-a sugerat anterior din mobilitățile diferite ale titinelor scheletice și cardiace pe geluri SDS,2021 este acum clar că titina este exprimată în diferite izoforme în diverse țesuturi musculare.8 Titina cardiacă umană, de exemplu, este codificată de un ARNm gigant de 82-kb, care conține un cadru de citire deschis de 81-kb care codifică o peptidă de 27 000 de reziduuri (Mr, 2993 kD). În schimb, titina umană din soleus este o polipeptidă semnificativ mai mare, cu o masă moleculară de ≈3700 kD. Aceste diferențe sunt rezultatul unei serii de evenimente de splicing alternativ al titinei din banda I în diferitele țesuturi musculare.8

Elasticitatea titinei

Când fibrele musculare striate relaxate sunt întinse, rezultă o forță de retracție, care este denumită tensiune pasivă sau de repaus (rigiditate). Se știe de mult timp că mușchiul cardiac este mult mai rigid decât mușchiul scheletic. Anterior, s-a crezut că rigiditatea pasivă ridicată a țesutului muscular cardiac provine în principal din complianța scăzută a structurilor extracelulare, cum ar fi colagenul22 , dar odată cu apariția preparatului de miocite unice23 , a devenit clar că structurile rigide trebuie să fie localizate, cel puțin parțial, în interiorul celulei.2425 Elementele extracelulare rigide, care ajută la prevenirea întinderii excesive a țesutului muscular, pot fi găsite numai la tensiuni mai extreme. Recent, s-a putut demonstra, de asemenea, că se dezvoltă o forță pasivă semnificativă la întinderea miofibrilelor relaxate, singure și izolate, specimenele cardiace fiind cu aproximativ un ordin de mărime mai rigide decât preparatele scheletice.19 Se știe acum că aceste diferențe de rigiditate rezultă din exprimarea specifică tipului de mușchi a unor variante de titină de diferite lungimi sau, mai precis, din exprimarea diferențială a două familii distincte de motive de titină în banda I (Fig. 1).813 Un tip de motiv este reprezentat de domenii Ig dispuse în tandem. Cel mai rigid mușchi striat al vertebratelor, inima, exprimă 40 de domenii Ig în tandem, în timp ce mușchiul soleus, mult mai flexibil, exprimă 93 de domenii Ig în tandem. Celălalt segment de titină din banda I exprimat diferențiat este un tip de motiv distinct denumit domeniu PEVK, deoarece reziduurile de prolină, glutamat, valină și lizină constituie ≈70% din secvența sa.8 Acest domeniu PEVK este, de asemenea, cel mai scurt în inimă și mult mai lung în mușchiul scheletic: regiunea PEVK cardiacă umană cuprinde 163 de reziduuri, în timp ce regiunea PEVK a mușchiului solear uman are ≈2200 de reziduuri (Fig. 1).8

Descoperirea expresiei diferențiate atât a regiunii PEVK, cât și a regiunii tandem-Ig a titinei a făcut necesară identificarea contribuției relative a acestor două segmente distincte ale benzii I la elasticitatea miofibrilelor. O astfel de identificare a fost recent încercată prin monitorizarea poziției epitopilor anticorpilor selectați ai benzii I a titinei în miofibrilele unice întinse13 sau în fibrele musculare14 , în plus față de măsurarea răspunsului pasiv la tensiune al specimenelor (Fig. 2; a se compara cu Referința 13 ). S-a sugerat că, la o lungime slabă a sarcomerului, domeniile titinei din banda I se află în stare compactă, în timp ce o întindere mică poate induce îndreptarea regiunilor tandem-Ig.13142728 Această extensie inițială este corelată cu o creștere mică (mușchi cardiac) sau chiar neglijabilă (mușchi scheletic) a tensiunii pasive doar202125 și, prin urmare, este posibil să nu fie provocată de desfășurarea modulelor tandem-Ig, despre care s-a demonstrat că se pliază independent în domenii stabile din punct de vedere termodinamic.9 La întinderi moderate sau lungi, principala extensie pare să aibă loc în cadrul regiunii PEVK, cel puțin în miofibrilele scheletice1314 , în timp ce tensiunea pasivă crește în mod constant (Fig. 2). În miofibrilele cardiace, regiunea PEVK8 scurtă poate susține, de asemenea, tensiunea pasivă, dar numai într-o măsură limitată (a se compara cu legenda la Fig. 2). Odată ce extensibilitatea segmentului PEVK a fost epuizată, tensiunea pasivă ar putea fi determinată în principal de desfășurarea domeniilor Ig2728 ; cu toate acestea, deoarece lungimea maximă a sarcomerelor cardiace nu depășește ≈2,4 μm in vivo, este puțin probabil ca o astfel de desfășurare să aibă loc în condiții fiziologice.13

În concluzie, extensibilitatea ridicată a regiunii PEVK în timpul unor cantități fiziologice de întindere1314 sugerează că acest domeniu este capabil să se desprindă într-un lanț polipeptidic extins. Prin urmare, regiunea PEVK a titinei și domeniile tandem-Ig pot constitui un sistem cu două arcuri care acționează în serie. Expresia specifică țesutului a celor două arcuri în diferite variante de lungime poate explica acum de ce proprietățile mecanice pasive ale mușchilor striați sunt atât de diverse. Exprimarea diferitelor lungimi ale segmentelor tandem-Ig în diferite tipuri de mușchi ar putea fi importantă pentru stabilirea lungimii sarcomerelor slabe fiziologice, în timp ce splicarea diferențială a secvențelor bogate în PEVK poate controla rigiditatea caracteristică a unui țesut muscular relaxat. O sarcină importantă acum este de a descoperi ce structură terțiară permite regiunii PEVK a titinei să sufere modificări conformaționale masive și rapid reversibile care determină în principal tensiunea pasivă și elasticitatea miofibrilară.

Roluri emergente ale titinei în biologia celulelor musculare

În prezent, nu se știe ce mecanisme de transducție a semnalelor celulare pot controla traducerea, asamblarea și, de asemenea, dezasamblarea și rotația polipeptidei gigantice de titină în timpul miogenezei și creșterii. Titina conține sute de situsuri de legare pentru miozină, proteina C și proteinele din linia M715 și, probabil, pentru un număr semnificativ de proteine din discul Z și banda I neidentificate încă. Prin urmare, cum controlează celula musculară traducerea peptidei titină de 27 000 până la 33 000 de reziduuri și cum poate fi strâns cuplată sinteza titinei cu asamblarea liganzilor titinei în timpul miogenezei? Un model atractiv ar fi acela că ARNm al titinei, miozinei și proteinei C sunt colocalizate și asamblate prin cotraducere29 , forțând astfel lanțurile peptidice născute în plasa proteică a ordinii paracristaline întâlnite in vivo. În mod clar, o mai bună înțelegere a modului în care ansamblul supramolecular titină/filament gros este capabil să constituie o plasă tridimensională foarte ordonată trebuie să provină acum dintr-o caracterizare biochimică a fragmentelor de titină, miozină și proteină C exprimate și, poate, din studii privind metabolismul ARNm al titinei.

Un alt mecanism de control al asamblării filamentului de titină ar putea fi implicat în unele trăsături caracteristice ale secvenței de titină: pe lângă regiunea PEVK și cele 244 până la 297 de copii de repetări structurale Ig și FN3 (în funcție de tipul de mușchi), titina conține, de asemenea, 19 inserții unice de secvențe, care împreună constituie ≈300 kD, sau 8% până la 10%, din masa titinei.8 Două inserții de secvențe unice, situate în regiunile N-terminală și C-terminală ale titinei, codifică motive SP dispuse în tandem (Fig. 1). Reziduurile de serină din repetițiile SP pot fi fosforilate in vitro de către extractele musculare,3031 și acest lucru ar putea explica de ce titina devine rapid marcată in vivo atunci când fosfatul este injectat în animale.32 Este posibil ca, astfel, căi de fosforilare/defosforilare încă neidentificate să controleze asamblarea filamentului de titină. În viitor, ar trebui să fie interesant de investigat consecințele funcționale ale fosforilării la capetele discului Z și ale liniei M ale titinei.

Una dintre inserțiile de secvențe unice ale titinei, situată aproape de extremitatea C-terminală, codifică un domeniu serină/treonină kinază (Fig. 1).7 Acest domeniu și organizarea repetărilor Ig și FN3 care îl flanchează sunt foarte asemănătoare cu cele ale proteinelor uriașe de nevertebrate, twitchin și projectin.3334 Recent, s-a demonstrat că twitchin kinaza twitchin de la moluștele Aplysia a fost activată cu mai multe ordine de mărime prin intermediul cofactorului S100, un cofactor omniprezent reglat de calciu.37 Prin urmare, se pare că este probabil ca filamentele twitchin – și poate și titin – să reprezinte un nou sistem de filamente sensibile la calciu în mușchi. În ciuda cunoștințelor din ce în ce mai multe despre factorii care controlează activitatea kinazelor titin/twitchin pe substraturi artificiale, substratul veritabil al acestor kinaze (și, prin urmare, rolul lor fiziologic) rămâne necunoscut.

Pentru a înțelege mai bine fiziologia asamblării/dezasamblării titinului la nivel molecular, descoperirea situsurilor specifice de legare pe titin pentru proteinaza calpaină, p94,16 ar putea fi un pas important (a se compara cu Fig. 1). Spre deosebire de calpainele omniprezente exprimate în toate tipurile de celule, p94 este exprimată numai în țesuturile musculare. Utilizând p94 ca momeală pentru un screening cu două hibride de drojdie, au fost identificate două locații distincte de legare a p94 pe filamentul de titină.16 Primul loc este situat în regiunea centrală a titinei din banda I. Este posibil ca scindarea titinei la acest situs de către p94 sau proteazele reglementate de p94 să explice de ce titina se degradează cu ușurință în așa-numita titină T2 (sau beta-connectină).3 Apoi, T2 ar putea fi un produs fiziologic de degradare a titinei implicat în reînnoirea miofibrilară. Mai mult, cel de-al doilea situs de legare pe titină pentru p94 este situat la capătul C-terminal al filamentului, coincizând cu ultima inserție de secvență unică a titinei (Fig. 1). Deși nu este clar de ce sunt prezente în titină cel puțin două situsuri de legare distincte pentru p94, o posibilitate este că – întrucât p94 solubil este extrem de rapid degradabil și are un timp de înjumătățire de 30 de minute – situsurile de legare a p94 din titină pot funcționa pentru a sechestra proteina calpaină într-o stare stabilizată complexată. În mod interesant, motivul C-terminal de legare a p94 din titină este sărit în unele țesuturi musculare prin splicing diferențial,38 ceea ce adaugă un nivel suplimentar de complexitate interacțiunilor dintre p94 și titină și ridică posibilitatea unui control specific țesuturilor asupra stabilității titinei.

Aspecte fiziopatologice

În cele din urmă, o înțelegere moleculară a interacțiunilor dintre filamentul de titină și p94 sau alte proteaze calpainice ne-ar putea răsplăti cu o înțelegere mai aprofundată a degenerării și regenerării musculare, în special în ceea ce privește situația fiziopatologică. Un studiu atent al proteinelor prezente în biopsiile musculare de la pacienți normali și distrofici a evidențiat degradarea titinei în DMD și FCMD.39 Mai recent, s-a constatat că mutațiile în calpaina proteazei p94 specifică mușchilor cauzează LGMD-2A.40 Deoarece titina oferă situsuri de legare specifice pentru p94,16 se ridică posibilitatea intrigantă ca distrofiile musculare distincte din punct de vedere genetic, cum ar fi FCMD, DMD și LGMD-2A, să aibă în comun o dereglare a interacțiunii p94-titină, care duce apoi la o fragilitate patologică a sistemului de filamente de titină ca mecanism comun, secundar, al bolii.

În rezumat, filamentele de titină joacă un rol important atât în funcționarea fiziologică, cât și fiziopatologică a mușchiului. În timp ce o structură regulată de titină în banda A pare a fi critică pentru o asamblare ordonată a sarcomerelor, este clar că elasticitatea titinei din banda I determină proprietățile mecanice pasive ale miofibrilei. În viitor, o mai bună înțelegere moleculară a proprietăților elastice ale titinei din banda I ar putea evolua în urma unei abordări combinate, utilizând atât tehnici biofizice, cât și tehnici de biologie moleculară. În ceea ce privește potențiala activitate kinazică a titinei și rolul său anticipat în transducția semnalului, așteptăm încă o explorare mai detaliată. În cele din urmă, pentru a descoperi în continuare implicarea titinei în procesele fiziopatologice, va fi necesar să se studieze modulele de titină exprimate pentru posibile interacțiuni cu alte proteine miofibrilare și citosolice, caracterizând astfel funcțional aceste interacțiuni la nivel molecular.

Selecție de abrevieri și acronime

Note de subsol