O teple a buňkách a bílkovinách

Podle všeobecně přijímaného názoru se vyšší formy života řídí okolní teplotou, protože prakticky všechny biochemické procesy jsou závislé na teplotě. Extrémní teploty okolního vzduchu na Zemi se pohybují od -89,2 °C (naměřeno 21. července 1983, Wostock, Antarktida) do +58 °C (naměřeno 13. září 1922, Al Azizyah, Libye). Navzdory těmto teplotním extrémům mají homeotermní druhy, jako je člověk, schopnost regulovat teplotu svého tělesného jádra v úzkém rozmezí do 37 °C díky autonomním mechanismům regulace teploty. Schopnost udržovat relativně stálou vnitřní teplotu umožnila homeotermním živočichům být nezávislými na vlivu kolísání teploty prostředí. Kromě toho jsou u homeotermních živočichů popsány pozoruhodné adaptace na teplo a chlad. Zatímco aklimatizace na teplo je dosaženo během několika týdnů, například pouhým zvýšením rychlosti pocení, aklimatizace na chlad je dosaženo až po několikaletém vystavení chladnému prostředí. Nejlépe prostudovanou populací, pokud jde o aklimatizaci na chlad, jsou tradiční korejští a japonští potápěči zvaní Ama. Při jejich potápění v 10 °C studené mořské vodě byly pozorovány rektální teploty v rozmezí 37 °C až 34,8 °C (7). Když fyziolog Suki Hong studoval tyto ženy na počátku 60. let 20. století, jejich bazální metabolická rychlost během zimních měsíců, kdy se potápěly ve velmi studené vodě, byla výrazně vyšší než hodnoty pozorované během teplejších měsíců. Aby tento kalorický deficit vyrovnaly, zvýšily spotřebu potravy o ~1 000 kcal ve srovnání s nepotápěči. Kromě toho byla míra třesu ve studené vodě snížena ve srovnání s kontrolními ženami, které se nepotápěly. Když však Hong své studie v 90. letech 20. století zopakoval, Ama již nevykazovaly zvýšenou metabolickou kapacitu, protože se (naštěstí) již nepotápěly v tradičních bavlněných plavkách, ale byly vybaveny neoprénovými obleky proti chladovému stresu.

Teplota tělesného jádra studenokrevných živočichů, tzv. poikilotermních živočichů, závisí na okolní teplotě. U poikilotermních živočichů je teplota nejdůležitějším faktorem prostředí, kterým se řídí rozšíření druhů. Teplotních extrémů dosahují poikilotermní vodní živočichové. Extrémním stenotermem je antarktická ryba z podřádu teleostů Nototheniodei, která žije v chladných, teplotně stabilních vodách pobřeží Antarktidy, kde se teploty pohybují od +0,3 °C do -1,86 °C. V roce 1998 byl popsán mnohoštětinatý červ Alvinella pompejana žijící v koloniích, který obývá hlubokomořské hydrotermální teploty nad +80 °C a má teplotní gradient 60 °C a více po celé délce těla.

Ačkoli systémové mechanismy adaptace na změny teploty jsou dobře známy, mnohem méně se ví o adaptaci na buněčné nebo genetické úrovni. Život, nahlížený z buněčné perspektivy, vykazuje vysoké teplotní výkyvy i v tělech homeotermů (obr. 1). Při pobytu na slunci lze na kůži naměřit teplotu až +45 °C, což odpovídá teplotě na Sahaře. Myocyty jsou v pracujícím svalu vystaveny teplotám až 40 °C. Nejnižší a nejvyšší teploty tělesného jádra, které byly přežity v případech náhodného podchlazení nebo hypertermie, jsou ~30 °C a ~43 °C. Systémově jsou teploty vnímány prostřednictvím chladových a tepelných receptorů na specializovaných somatosenzorických neuronech savců. Tyto receptory patří do rodiny iontových kanálů s přechodnými receptorovými potenciály, které převádějí teplotní podněty na elektrické potenciály. Na buněčné úrovni je však každá buňka schopna reagovat na změnu teploty zvýšenou nebo sníženou produkcí proteinů. Sonna et al. (15) zjistili pomocí metody čipového pole 227 upregulovaných a 168 downregulovaných genů (z 12 600 zkoumaných) po vystavení mononukleárních buněk periferní krve teplotě 43 °C po dobu 20 minut. Podskupina těchto proteinů, proteiny tepelného šoku (HSP), se specializuje na ochranu buněk před poškozením způsobeným teplem. Podobně jako u specifické reakce na teplo je každá buňka schopna zvýšené produkce proteinů chladového šoku (CSP) v reakci na snížení teploty.

V roce 1962 objevil Ritossa ve své průkopnické práci HSP. Po zvýšení teploty v inkubátoru s kulturami drozofil pozoroval pozoruhodné změny ve vzorcích chromozomálního pučení, tj. vzorcích genové aktivity polytenových chromozomů ve slinných žlázách larev. Dnes je dobře známo, že v reakci na mnoho stresů, včetně tepla, oxidačních podmínek a vystavení toxickým sloučeninám, produkují všechny buňky společný soubor HSP. Název těchto proteinů byl však odvozen od prvního spouštěče (tj. tepla), u kterého bylo zjištěno, že zvyšuje jejich syntézu. Zvýšená exprese HSP je zprostředkována na několika úrovních: syntéza mRNA, stabilita mRNA a účinnost translace. Pokusy s různými druhy zvířat ukázaly, že zvýšená exprese těchto proteinů může chránit organismus před poškozením vyvolaným stresem. Kromě toho buňky, kterým byl podán předšok vyvolávající HSP, který není smrtelný, následně přežijí jinak smrtelnou expozici zvýšeným teplotám. Je pozoruhodné, že vzorce exprese HSP vykazují vysokou míru zachování mezi různými druhy. Předpokládá se tedy, že reakce na tepelný šok je mezi organismy prakticky univerzální. Ve dvou případech ryb vystavených chladnému, tepelně stabilnímu prostředí (Hydra oligatis a Trematomus bernacchii) však nebyla zjištěna žádná reakce na tepelný šok.

Existuje řada příkladů, které ukazují, že exprese HSP se může u lidí měnit v závislosti na teplotě prostředí, a to navzdory jejich schopnosti udržovat konstantní teplotu tělesného jádra. Zvýšená syntéza HSP byla pozorována in vivo během cvičení v srdečním svalu v závislosti na okolní teplotě ovlivňující adaptaci myokardu (6). Změny exprese HSP72 v leukocytech jsou spojeny s adaptací na cvičení v podmínkách vysoké teploty prostředí. Význam HSP pro systémovou adaptaci na prostředí je dobře prokázán především u poikilotermních zvířat. Tyto studie také ukazují, že teplota, při které se aktivují geny HSP, podléhá tepelné aklimatizaci v závislosti na ročním období nebo jiných změnách střední teploty prostředí. Souhrnně lze říci, že HSP se vyvinuly jako obecné stresem indukovatelné proteiny pro udržení buněčné integrity (11). Tento mechanismus odolnosti však neprobíhá pouze v patofyziologických situacích, ale je adaptován i ve fyziologii savců, například v osmotické odolnosti keratinocytů nebo ledvinových buněk, kde fyziologické osmotické podmínky (prostřednictvím změny vlhkosti, respektive akumulace chloridu sodného/močoviny) vedou ke zvýšené expresi HSP (2).

HSP a molekulární chaperony

Za normálních (nestresových) podmínek molekulární chaperony pomáhají při běžném skládání a kompartmentalizaci nově syntetizovaných proteinů a podílejí se také na řadě dalších buněčných funkcí. Během tepelného nebo jiného stresu se tepelně indukované HSP vážou na denaturované proteiny, čímž zabraňují jejich agregaci a pomáhají při jejich opětovném skládání do nativního, funkčního stavu po obnovení okolní teploty. HSP byly v eukaryotických buňkách klasifikovány podle své molekulové hmotnosti. Dosud bylo identifikováno šest rodin HSP (HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40 a malé HSP). Protože exprese některých členů rodin HSP se zvyšuje při hladovění glukózou, nazývají se tyto proteiny proteiny regulované glukózou. Některé HSP, které byly poprvé objeveny nezávisle na své roli stresových proteinů (jako ubikvitin nebo αB-krystalin), nesou své zvláštní názvy. Přehled rodin chaperonových proteinů a jejich struktury a funkce je uveden v tabulce 1. Zejména HSP90 a HSP70 hrají důležitou roli při udržování buněčných funkcí za nestresových a stresových podmínek.

HSP90 rodina

HSP90 jsou vysoce konzervované proteiny, které představují 1-2 % obsahu všech buněčných proteinů. HSP90 se skládají ze tří strukturních domén identifikovaných proteolytickým štěpením. NH2-koncová doména o velikosti ~25 kDa je spojena s vysoce konzervovanou COOH-koncovou oblastí o velikosti ~55 kDa pomocí nabitého linkeru, jehož délka a složení se u jednotlivých druhů a izoforem liší. Byly popsány dvě kapsy vázající ATP, jedna se nachází v NH2-koncové a druhá v COOH-koncové oblasti. Po navázání ATP nebo zahřátí se HSP90 přepíná z formy, ve které jsou obě NH2-koncové domény v dimeru oddělené, na formu, ve které jsou spojené, čímž vzniká toroidální dimerní struktura. Předpokládá se, že tato konformační změna je zodpovědná za vazbu substrátu. HSP90 působí jako molekulární chaperon závislý na ATP, který se podílí na skládání a aktivaci neznámého počtu substrátových proteinů, včetně steroidních hormonálních receptorů, proteinkináz a transkripčních faktorů (14). Vytvoření komplexu těchto klientských proteinů s HSP90 je předpokladem jejich stability a funkčnosti. Proto jsou chaperony patřící do rodiny HSP90 klíčovými hráči v buněčných dějích, jako je replikace DNA, transkripce RNA, skládání proteinů, zrání, translokace přes endoplazmatické retikulum a mitochondriální membrány, proteolýza a buněčná signalizace. HSP90 vykazuje silnou specifičnost pro své klientské proteiny. Samotný HSP90 však není schopen podporovat skládání a/nebo aktivaci žádného ze svých známých substrátových proteinů. Pro plnou aktivitu je nutná souhra HSP90 s dalšími HSP a ko-chaperony. V případě progesteronového receptoru je zapojeno nejméně sedm dalších proteinů (HSP70, Hip, Hop, imunofiliny a p23). Na základě modelu progesteronového receptoru dochází k cyklování substrátu mezi časným komplexem (obsahujícím HSP70 a Hop), přechodným komplexem (obsahujícím HSP70, Hop a dimer HSP90) a zralým komplexem (obsahujícím dimer HSP90 a p23) s nutností hydrolýzy ATP. Význam HSP90 pro buněčné funkce je demonstrován použitím specifických antagonistů HSP90, jako je geldanamycin (GA), kteří obsazují ATP vazebnou kapsu HSP90, čímž zabraňují cyklování heterokomplexu HSP90. Buňky ošetřené GA vykazují nedostatky v buněčném růstu i ve stabilitě a aktivaci proteinkináz a transkripčních faktorů (9). Význam funkce chaperonu HSP90 pro buněčnou fyziologii nejlépe ilustruje jeho interakce s transkripčními faktory. Vzhledem k tomu, že HSP90 chaperonuje transkripční faktor zodpovědný za expresi genů závislých na kyslíku, tj. hypoxií indukovaný faktor-1α, dochází u buněk ošetřených GA k poruše fyziologické odpovědi buněk na snížení napětí kyslíku.

RodinaHSP70

Bílkoviny související s tepelným šokem o velikosti 70 kDa tvoří rodinu vysoce konzervovaných molekulárních chaperonů, které regulují skládání proteinů za normálních i stresových podmínek (3). HSP70, stejně jako HSP90, patří k nejhojnějším z těchto proteinů a tvoří až 1-2 % celkových buněčných proteinů. Proteiny HSP70 podporují skládání vznikajících řetězců na ribozomech, translokaci proteinů přes membrány a ochranu při vysokých teplotách prostřednictvím interakce s obnaženými hydrofobními povrchy nesložených nebo částečně složených proteinů. Proteiny HSP70 obsahují dvě domény, NH2-koncovou ATPázovou doménu a COOH-koncovou peptidovou vazebnou doménu. Peptidová vazebná doména HSP70 váže sedmireziduální peptid v prodloužené konformaci mezi subdoménou β-listu a α-helikální subdoménou. Předpokládá se, že vazba ATP na ATPázovou doménu spouští uvolnění substrátu tím, že způsobí ohnutí α-domény směrem nahoru v pružném spoji blízko středu dlouhé šroubovice, která se táhne nad peptidem. Bylo prokázáno, že ko-chaperony HSP70, jako jsou Hip, Hop, HSP40 a Bag-1, hrají důležitou roli v modulaci aktivity HSP70 i v modulaci substrátové specifity proteinu. Hip je 50-kDa cytosolový protein, o kterém bylo zjištěno, že interaguje s ATPázovou doménou členů rodiny HSP70 a zvyšuje interakci se substrátem. Hop je jedinečný ko-chaperon, který má schopnost interagovat s chaperonovým mechanismem HSP70 i HSP90 v různých systémech. V nepřítomnosti HSP40 a ATP se HSP70 přednostně váže na peptidy a denaturované proteiny. V přítomnosti HSP40 však HSP70 vykazuje širší škálu substrátové specifity. Bag-1 byl původně objeven jako protein asociovaný s Bcl-2. Kromě interakce s antiapoptotickými členy rodiny proteinů Bcl-2 Bag-1 také specificky interaguje s HSP70. Během stresových podmínek lze pozorovat zvýšenou tvorbu komplexů Bag-1-HSP70. Generování cíleného přerušení genu HSP70.1 nebo HSP70.3 podtrhuje význam HSP70 při udržování získané termotolerance a snížené citlivosti k apoptóze vyvolané teplem (8).

HSP: buněčný teploměr

Indukovatelná exprese HSP je regulována transkripčními faktory tepelného šoku (HSF) (13). U obratlovců byly dosud identifikovány čtyři různé HSFs. Existence více HSFs naznačuje funkční odlišnosti HSFs. Na rozdíl od HSF1 a HSF3 není HSF2 aktivován v reakci na klasické stresové podněty. HSF1 však vykazuje typické rysy stresové indukce, vazby na DNA, oligomerizace a jaderné lokalizace v reakci na environmentální stresory, jako je zvýšená teplota a expozice síranu kademnatému a analogům aminokyselin. Během genové exprese je transaktivace genů tepelného šoku zprostředkována interakcí mezi HSF1 a elementem tepelného šoku, který se nachází v promotoru všech genů HSP. Při nestresových teplotách je HSF1 přítomen v cytosolu jako neaktivní monomerní protein, který je vázán na HSP70 a HSP90 (obr. 2). Po tepelném šoku se HSP70 a HSP90 rekrutují, aby vázaly denaturované proteiny, a proto se z HSF1 uvolňují. Nenavázaný HSF1 se lokalizuje do jádra, trimerizuje a získává schopnost vázat DNA. HSF1 se fosforyluje na serinových zbytcích, což vede k aktivaci genů HSP včetně HSP70 a HSP90. Následně je aktivita HSF1 negativně regulována prostřednictvím zvýšené vazby nově syntetizovaných HSP70 a HSP90 na HSF1. Ústředním procesem buněčného vnímání teploty je tedy rovnováha mezi vazbou volných HSP na HSF1 nebo na stresem denaturované proteiny.

Buněčná smrt: apoptóza a nekróza

Vystavení buněk působení tepla může vést k apoptóze nebo nekróze v závislosti na použité teplotě. Nejzajímavější je, že prahová teplota indukce apoptózy na buněčné úrovni odpovídá bezpečně tolerované horní prahové teplotě systémového jádra u člověka. Pro indukci nekrózy musí být in vitro použity vyšší teploty než teploty vyvolávající apoptózu (10). Bylo prokázáno, že exprese malých HSP nebo indukovatelného HSP70 zvyšuje přežití savčích buněk vystavených mnoha typům podnětů, jako je teplo nebo jiné formy apoptotických stresových podnětů (1). Zatímco je třeba předpokládat, že antinekrotická funkce souvisí s chaperonovou funkcí zejména HSP70 a HSP27, přesný mechanismus antiapoptotické funkce obou HSP není zcela jasný. Zdá se, že existuje více možností interakce HSP70 s apoptotickými drahami. HSP70 údajně interaguje s Apaf-1, čímž brání jeho interakci s prokaspázou-9 a nakonec apoptóze závislé na kaspáze. Nedávno bylo prokázáno, že HSP70 se účastní také apoptotických dějů nezávislých na kaspáze prostřednictvím specifické interakce s faktorem indukujícím apoptózu, který se uvolňuje z mitochondrií na počátku apoptotického procesu.

Odpověď na chladový šok

Stres chladem mění lipidové složení buněčných membrán a potlačuje rychlost syntézy proteinů a proliferaci buněk. Soubor proteinů nazývaný CSP je však exprimován ve vyšších hladinách již od teploty 32 °C. Hypotermie indukuje expresi proteinů vázajících RNA, jako je protein CIRP (cold-inducible RNA-binding protein), první CSP identifikovaný v savčích buňkách, a protein s motivem vazby RNA 3 (4, 12). Podobně jako HSP je i CIRP exprimován při 37 °C a vývojově regulován, přičemž pravděpodobně funguje jako RNA chaperon. Buněčná a molekulární biologie savčích buněk při teplotě 32 °C je novou oblastí, u níž se očekává, že bude mít značný význam pro fyziologii, například u varlat a kůže, kde je teplota buněk obvykle 30-34 °C, respektive ~33 °C.

HSP jsou spojovacím článkem mezi teplotou prostředí a buněčnou funkcí

HSP a CSP jsou evolučně nejkonzervativnější odpovědí na změny teploty. Ačkoli byly tyto proteiny objeveny již dávno a molekulární funkce těchto proteinů jsou stále více pochopeny, souvislost mezi účinky zprostředkovanými teplotou/HSP/CSP a buněčnými funkcemi je méně prozkoumána. Vystavení buněk zvýšené teplotě ovlivňuje nejen expresi a aktivitu HSP, ale také interakci HSP s partnerskými proteiny. Například zvýšení exprese a aktivity HSP90 vlivem zvýšené teploty in vitro nebo in vivo ovlivňuje stabilitu a aktivitu transkripčních faktorů, jako je glukokortikoidní receptor nebo hypoxií indukovaný faktor 1α. Okolní teplota tak ovlivňuje expresi genů zpočátku prostřednictvím přímé aktivace teplem indukovatelných genů a následně nepřímo prostřednictvím změněné exprese a aktivity HSP.

Další výhledy

K určení vlivu změn teploty v homeotermickém těle na buněčné funkce a expresi genů je zapotřebí dalších studií, protože ve většině studií in vitro je jednoduše simulována teplota tělesného jádra 37 °C. Tato teplota však představuje pouze jádro našeho těla a zanedbává dynamické změny teploty v ostatních částech za fyziologických a patofyziologických podmínek. Význam přesné regulace teploty u homeotermů nejlépe ilustruje varle. I mírné zvýšení teploty šourku (která je normálně 30-34 °C) je spojeno s neplodností. To se částečně přičítá vyšší expresi proteinů HSP90 a buněčné smrti zprostředkované p53 a také snížené expresi CSP. To je pravděpodobně jeden z nejdramatičtějších příkladů potřeby teplotní adaptace k „oplodnění“ naší planety.

.