Over Warmte en Cellen en Eiwitten

De gangbare wijsheid is dat hogere levensvormen worden beheerst door de omgevingstemperatuur, omdat vrijwel alle biochemische processen temperatuurafhankelijk zijn. De extreme omgevingstemperaturen op aarde variëren van -89,2°C (gemeten op 21 juli 1983, Wostock, Antarctica) tot +58°C (gemeten op 13 september 1922, Al Azizyah, Libië). Ondanks deze extreme temperaturen hebben homeothermische soorten, zoals de mens, het vermogen om hun lichaamstemperatuur binnen een smal bereik tot 37°C te regelen, dankzij autonome temperatuurregelingsmechanismen. Het vermogen om een relatief constante inwendige temperatuur te handhaven heeft homeothermische dieren in staat gesteld onafhankelijk te zijn van de invloed van schommelingen in de omgevingstemperatuur. Bovendien zijn bij homeothermen opmerkelijke aanpassingen aan warmte en koude beschreven. Terwijl warmteacclimatisatie binnen enkele weken wordt bereikt, bijvoorbeeld door een eenvoudige verhoging van de transpiratiesnelheid, wordt acclimatisatie aan koude pas bereikt na blootstelling aan een koude omgeving gedurende jaren. De best bestudeerde populatie wat koudeacclimatisatie betreft zijn de traditionele Koreaanse en Japanse duikers die Ama worden genoemd. Tijdens hun duikarbeid in 10°C koud zeewater werden rectale temperaturen tussen 37°C en 34,8°C waargenomen (7). Toen de fysiologe Suki Hong deze vrouwen in het begin van de jaren 1960 bestudeerde, bleek hun basaal metabolisme tijdens de wintermaanden, wanneer zij in zeer koud water doken, aanzienlijk hoger te zijn dan de waarden die tijdens warmere maanden werden waargenomen. Om dit calorisch tekort te compenseren, steeg hun voedselconsumptie met ~1.000 kcal in vergelijking met niet-duikers. Bovendien was de rilsnelheid in koud water lager in vergelijking met niet-duikende controle vrouwen. Toen Hong zijn studies in de jaren 1990 herhaalde, vertoonden de Ama echter niet langer de verhoogde stofwisselingscapaciteit, omdat ze (gelukkig) niet langer in hun traditionele katoenen badpakken doken, maar werden voorzien van wetsuits om de koude stress te bestrijden.

De kernlichaamstemperatuur van koudbloedige dieren, de zogenaamde poikilothermische dieren, is afhankelijk van de omgevingstemperatuur. Bij poikilothermische dieren is de temperatuur de belangrijkste omgevingsfactor die de verspreiding van de soorten bepaalt. Temperatuurextremen worden bereikt bij poikilothermische waterdieren. De Antarctische vis van de teleost-onderorde Nototheniodei is een extreme stenotherm, die leeft in de koude, thermisch stabiele wateren van de kust van Antarctica, waar de temperatuur varieert van +0,3°C tot -1,86°C. In 1998 werd de in kolonies levende polychaete worm Alvinella pompejana beschreven, die in diepzee hydrothermale temperaturen van meer dan +80°C bewoont en een thermische gradiënt van 60°C of meer over zijn lichaamslengte heeft.

Hoewel de systemische mechanismen van aanpassing aan temperatuursveranderingen goed bekend zijn, is er veel minder bekend over de aanpassing op cellulair of genetisch niveau. Het leven, gezien vanuit het cellulaire perspectief, vertoont hoge temperatuurvariaties, zelfs in de lichamen van homeothermen (Fig. 1). Temperaturen tot +45°C kunnen op de huid worden gemeten tijdens blootstelling aan de zon, wat overeenkomt met de temperatuur in de Sahara. Myocyten worden blootgesteld aan temperaturen tot 40°C in de werkende spier. De laagste en hoogste kerntemperatuur van het lichaam, die bij toevallige hypothermie of hyperthermie werden gemeten, bedragen respectievelijk ~30°C en ~43°C. Systemisch worden de temperaturen waargenomen via koude- en warmtereceptoren op gespecialiseerde somatosensorische neuronen van zoogdieren. Deze receptoren behoren tot de familie van ionenkanalen, die temperatuurstimuli omzetten in elektrische potentialen. Op cellulair niveau is elke cel echter in staat om op een temperatuursverandering te reageren met een verhoogde of verlaagde productie van eiwitten. Sonna et al. (15) ontdekten 227 geüpreguleerde en 168 gedownreguleerde genen (van de 12.600 onderzochte genen) door gebruik te maken van een chip array benadering na blootstelling van perifere bloed mononucleaire cellen aan 43°C gedurende 20 min. Een subset van deze eiwitten, de heat shock-eiwitten (HSP’s), zijn gespecialiseerd in het beschermen van cellen tegen door hitte veroorzaakte schade. Vergelijkbaar met de specifieke warmtereactie is elke cel in staat tot een verhoogde productie van cold shock-eiwitten (CSP) als reactie op een temperatuurdaling.

In 1962 ontdekte Ritossa in zijn pionierswerk de HSP’s. Na een verhoging van de temperatuur in een incubator met Drosophila-culturen, nam hij opmerkelijke veranderingen waar in de chromosomale puffingpatronen, d.w.z. de genactiviteitspatronen van de polytene chromosomen in de speekselklieren van de larven. Vandaag de dag is het algemeen bekend dat alle cellen als reactie op vele stressfactoren, waaronder hitte, oxiderende omstandigheden en blootstelling aan toxische verbindingen, een gemeenschappelijke reeks HSP’s produceren. De naam van deze proteïnen is echter afgeleid van de eerste trigger (hitte) waarvan werd vastgesteld dat hij de synthese ervan verhoogde. Verhoogde expressie van HSP’s wordt gemedieerd op meerdere niveaus: mRNA-synthese, mRNA-stabiliteit, en translatie-efficiëntie. Experimenten met verschillende diersoorten hebben aangetoond dat een verhoogde expressie van deze eiwitten het organisme kan beschermen tegen door stress veroorzaakte schade. Bovendien overleven cellen die een niet-dodelijke HSP-inducerende voorschok krijgen vervolgens een anders dodelijke blootstelling aan verhoogde temperaturen. Opvallend is dat de expressiepatronen van HSP’s een hoge graad van instandhouding vertonen tussen de verschillende soorten. Men denkt dus dat de reacties op hitteschokken vrijwel universeel zijn onder de organismen. In twee gevallen van vissen die werden blootgesteld aan een koude, thermisch stabiele omgeving (Hydra oligatis en Trematomus bernacchii), werd echter geen hitteschokrespons vastgesteld.

Er zijn talrijke voorbeelden die aantonen dat de expressie van HSP’s kan variëren met de omgevingstemperatuur bij de mens, ondanks zijn vermogen om een constante lichaamstemperatuur te handhaven. Verhoogde HSP synthese is waargenomen in vivo tijdens inspanning in de hartspier afhankelijk van de omgevingstemperatuur die de myocardiale adaptaties beïnvloedt (6). Veranderingen in HSP72 expressie in leukocyten zijn geassocieerd met aanpassing aan inspanning onder omstandigheden van hoge omgevingstemperatuur. Het belang van de HSP’s voor de systemische aanpassing aan de omgevingstemperatuur is goed aangetoond, vooral bij poikilothermische dieren. Deze studies tonen ook aan dat de temperatuur waarbij de HSP-genen geactiveerd worden, onderhevig is aan thermische acclimatisatie als functie van het seizoen of andere veranderingen in de gemiddelde omgevingstemperatuur. Collectief evolueerden de HSP’s als algemene stress-induceerbare proteïnen om de cellulaire integriteit te handhaven (11). Dit resistentiemechanisme vindt echter niet alleen plaats in pathofysiologische situaties, maar is ook aangepast in de fysiologie van zoogdieren, bijvoorbeeld in de osmotische resistentie van keratinocyten of niercellen, waar fysiologische osmotische omstandigheden (via verandering in vochtigheid of natriumchloride/ureum accumulatie, respectievelijk) resulteert in verhoogde expressie van HSP’s (2).

HSP’s en moleculaire chaperonen

Onder normale (niet-stressvolle) omstandigheden helpen moleculaire chaperonen bij de routinematige vouwing en compartimentering van nieuw gesynthetiseerde eiwitten, en zij nemen ook deel aan een verscheidenheid van andere cellulaire functies. Tijdens thermische of andere vormen van stress binden warmte-geïnduceerde HSP’s zich aan gedenatureerde eiwitten, waardoor hun aggregatie wordt voorkomen en zij helpen bij het opnieuw vouwen in een natieve, functionele toestand nadat de omgevingstemperatuur is hersteld. HSP’s zijn in eukaryote cellen geclassificeerd volgens hun moleculair gewicht. Tot op heden zijn er zes geïdentificeerde HSP-families (HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40, en de kleine HSP’s). Aangezien de expressie van sommige leden van de HSP-families toeneemt bij glucose hongersnood, worden deze eiwitten glucose-gereguleerde eiwitten genoemd. Sommige HSP’s, die voor het eerst ontdekt werden onafhankelijk van hun rol als stress-eiwitten (zoals ubiquitine of αB-crystalline) dragen hun specifieke naam. Een overzicht van de chaperonne-eiwitfamilies en hun structuur en functie wordt gegeven in tabel 1. Vooral HSP90 en HSP70 spelen een belangrijke rol bij het behoud van de cellulaire functie onder niet-stress- en stressomstandigheden.

HSP90 familie

HSP90s zijn sterk geconserveerde eiwitten, die 1-2% van het gehele cellulaire eiwitgehalte vertegenwoordigen. HSP90 bestaat uit drie structurele domeinen die door proteolytische digestie zijn geïdentificeerd. Het ~25-kDa NH2-terminale domein is verbonden met een zeer geconserveerd ~55-kDa COOH-terminale regio door een geladen linker, die variabel is in lengte en samenstelling tussen soorten en isovormen. Er zijn twee ATP-bindende pockets beschreven, één gelegen in het NH2-terminale en één in het COOH-terminale gebied. Bij ATP binding of warmte schakelt HSP90 over van een vorm waarin de twee NH2-terminale domeinen gescheiden zijn in het dimeer naar een vorm waarin ze geassocieerd zijn, waardoor een toroïdale dimeerstructuur ontstaat. Men denkt dat deze conformatieverandering verantwoordelijk is voor de binding van substraten. HSP90 fungeert als een ATP-afhankelijk moleculair chaperon dat betrokken is bij de vouwing en activering van een onbekend aantal substraateiwitten, waaronder steroïdhormoonreceptoren, eiwitkinasen en transcriptiefactoren (14). De complexvorming van deze cliënteiwitten met HSP90 is een eerste vereiste voor hun stabiliteit en functionaliteit. Daarom zijn chaperones die behoren tot de HSP90 familie belangrijke spelers in cellulaire gebeurtenissen, zoals DNA replicatie, RNA transcriptie, eiwitvouwing, maturatie, translocatie door het endoplasmatisch reticulum en mitochondriale membranen, proteolyse, en celsignalering. HSP90 vertoont een sterke specificiteit voor zijn cliënt-eiwitten. HSP90 alleen is echter niet in staat om de vouwing en/of activering van één van zijn bekende substraateiwitten te bevorderen. Voor volledige activiteit is het samenspel van HSP90 met andere HSP’s en co-chaperones vereist. In het geval van de progesteronreceptor zijn ten minste zeven extra eiwitten betrokken (HSP70, Hip, Hop, immunofilines, en p23). Op basis van het progesteronreceptormodel verloopt de cyclus van het substraat tussen een vroeg complex (met HSP70 en Hop), een intermediair complex (met HSP70, Hop en een HSP90-dimeer), en het rijpe complex (met een HSP90-dimeer en p23) met de noodzaak van ATP-hydrolyse. Het belang van HSP90 voor cellulaire functies wordt aangetoond door het gebruik van specifieke HSP90 antagonisten zoals geldanamycine (GA) die de ATP bindingspocket van HSP90 bezetten en zo de cyclus van het HSP90 heterocomplex verhinderen. Met GA behandelde cellen vertonen tekorten in celgroei en in stabiliteit en activering van proteïnekinasen en transcriptiefactoren (9). De betekenis van de HSP90 chaperonne-functie voor de celfysiologie wordt het best geïllustreerd door zijn interactie met transcriptiefactoren. Aangezien HSP90 de transcriptiefactor die verantwoordelijk is voor zuurstofafhankelijke genexpressie, d.w.z. de hypoxie-induceerbare factor-1α, chaperonneert, zijn met GA behandelde cellen gestoord in de fysiologische respons van cellen op een verlaging van de zuurstofspanning.

HSP70 familie

De 70-kDa hitteschok-gerelateerde proteïnen vormen een familie van sterk geconserveerde moleculaire chaperonnes die de eiwitvouwing reguleren tijdens normale en stressomstandigheden (3). HSP70 is, net als HSP90, een van de meest overvloedige van deze eiwitten, goed voor zo’n 1-2% van het totale cellulaire eiwit. HSP70 eiwitten bevorderen de vouwing van nascente ketens op ribosomen, translocatie van eiwitten over membranen, en bescherming bij hoge temperaturen via interactie met blootgestelde hydrofobe oppervlakken van ongevouwen of gedeeltelijk gevouwen eiwitten. HSP70-eiwitten bevatten twee domeinen, een NH2-terminaal ATPase-domein en een COOH-terminaal peptide-bindend domein. Het HSP70 peptide-bindende domein bindt een zeven-residue peptide in een verlengde conformatie tussen een β-sheet subdomein en een α-helicaal subdomein. Aangenomen wordt dat ATP-binding aan het ATPase-domein het vrijkomen van het substraat in gang zet door het α-domein naar boven te doen buigen op een flexibel knooppunt nabij het midden van de lange helix die zich over het peptide uitstrekt. Er is aangetoond dat HSP70 co-chaperones, zoals Hip, Hop, HSP40, en Bag-1, een belangrijke rol spelen in de modulatie van de HSP70 activiteit en de substraatspecificiteit van het eiwit. Hip is een 50-kDa cytosolisch eiwit waarvan werd aangetoond dat het interageert met het ATPase domein van HSP70 familieleden en de substraatinteractie versterkt. Hop is een uniek co-chaperon dat de mogelijkheid heeft om te interageren met zowel de HSP70 als de HSP90 chaperon machinerie in verschillende systemen. In afwezigheid van HSP40 en ATP bindt HSP70 zich bij voorkeur aan peptiden en gedenatureerde eiwitten. In aanwezigheid van HSP40 vertoont HSP70 echter een breder spectrum van substraatspecificiteit. Bag-1 werd oorspronkelijk ontdekt als een Bcl-2-geassocieerd eiwit. Naast zijn interactie met anti-apoptotische leden van de Bcl-2 eiwitfamilie, interageert Bag-1 ook specifiek met HSP70. Tijdens stress condities kan een verhoogde vorming van Bag-1-HSP70 complexen gevonden worden. Gerichte genverstoring van het HSP70.1 of het HSP70.3 gen onderstreept het belang van HSP70 in het behoud van verworven thermotolerantie en verminderde gevoeligheid voor hitte-geïnduceerde apoptose (8).

HSPs: the cellular thermometer

De induceerbare HSP expressie wordt gereguleerd door de heat shock transcriptiefactoren (HSFs) (13). In vertebraten zijn tot nu toe vier verschillende HSF’s geïdentificeerd. Het bestaan van meerdere HSFs suggereert functionele verschillen van de HSFs. In tegenstelling tot HSF1 en HSF3, wordt HSF2 niet geactiveerd in reactie op klassieke stress stimuli. HSF1 daarentegen vertoont de typische kenmerken van stress-induceerbaarheid, DNA-binding, oligomerisatie, en nucleaire lokalisatie in reactie op milieustressoren zoals verhoogde temperaturen en blootstelling aan cadmiumsulfaat en aminozuuranalogen. Tijdens genexpressie wordt transactivatie van hitteschokgenen gemedieerd door de interactie tussen HSF1 en het hitteschok-element dat in de promotor van alle HSP-genen voorkomt. Bij niet-stresserende temperaturen is HSF1 aanwezig in het cytosol als een inactief, monomeer eiwit dat gebonden is aan HSP70 en HSP90 (Fig. 2). Na een hitteschok worden HSP70 en HSP90 gerekruteerd om gedenatureerde eiwitten te binden en komen daardoor los van het HSF1. Het ongebonden HSF1 lokaliseert naar de kern, trimeriseert, en verkrijgt DNA-bindend vermogen. HSF1 wordt gefosforyleerd op serineresiduen, gevolgd door transactivatie van HSP-genen, waaronder HSP70 en HSP90. Vervolgens wordt de activiteit van HSF1 negatief gereguleerd via verhoogde binding van de nieuw gesynthetiseerde HSP70 en HSP90 aan HSF1. Het centrale proces voor cellulaire temperatuursensing is dus het evenwicht tussen de binding van vrije HSP’s aan HSF1 of aan stress-gedenatureerde eiwitten.

Celdood: apoptose en necrose

Cellen blootstellen aan hitte kan resulteren in apoptose of necrose, afhankelijk van de toegepaste temperatuur. Interessant is dat de drempeltemperatuur voor de inductie van apoptose op cellulair niveau gelijk is aan de veilig aanvaardbare bovendrempel van de systemische kerntemperatuur bij de mens. Voor de inductie van necrose moeten in vitro hogere temperaturen worden toegepast dan die welke apoptose induceren (10). Het is aangetoond dat de expressie van kleine HSP’s of van het induceerbare HSP70 de overleving verbetert van zoogdiercellen die worden blootgesteld aan talrijke soorten stimuli, zoals warmte of andere vormen van apoptotische stressstimuli (1). Hoewel moet worden aangenomen dat de antinecrotische functie verband houdt met de chaperonfunctie, vooral van HSP70 en HSP27, is het precieze mechanisme van de anti-apoptotische functie van beide HSP’s niet helemaal duidelijk. Er lijken meerdere mogelijkheden te zijn voor HSP70 om te interageren met apoptotische pathways. Naar verluidt interageert HSP70 met Apaf-1, waardoor diens interactie met procaspase-9 en uiteindelijk caspase-afhankelijke apoptose wordt verhinderd. Onlangs werd aangetoond dat HSP70 ook deelneemt aan caspase-onafhankelijke apoptotische gebeurtenissen via specifieke interactie met de apoptose-inducerende factor, die vroeg in het apoptoseproces vrijkomt uit mitochondriën.

De koudeschokreactie

Koude stress verandert de lipidensamenstelling van celmembranen en onderdrukt de snelheid van de eiwitsynthese en de celproliferatie. Een reeks eiwitten, CSP genaamd, komt echter op hogere niveaus tot expressie vanaf een temperatuur van 32°C. Onderkoeling induceert de expressie van RNA-bindende proteïnen zoals cold-inducible RNA-binding protein (CIRP), het eerste CSP dat in zoogdiercellen werd geïdentificeerd, en RNA-binding motif protein 3 (4, 12). Net als HSP komt ook CIRP tot expressie bij 37°C en wordt het ontwikkelingsgebonden gereguleerd, mogelijk werkend als een RNA-chaperon. De cellulaire en moleculaire biologie van zoogdiercellen bij 32°C is een nieuw gebied dat naar verwachting aanzienlijke implicaties zal hebben voor de fysiologie, bijvoorbeeld in de testis en de huid, waar de celtemperaturen typisch respectievelijk 30-34°C en ~33°C zijn.

HSP’s zijn de schakel tussen de omgevingstemperatuur en de cellulaire functie

De HSP’s en CSP’s zijn evolutionair gezien de meest geconserveerde reacties op temperatuursveranderingen. Hoewel de proteïnen reeds lang geleden ontdekt werden en de moleculaire functies van deze proteïnen meer en meer begrepen worden, is het verband tussen temperatuur/HSP/CSP-gemedieerde effecten en cellulaire functies minder onderzocht. Cellen blootstellen aan verhoogde temperaturen beïnvloedt niet alleen de expressie en activiteit van HSP’s, maar ook de interactie van HSP’s met partnereiwitten. Bijvoorbeeld, het verhogen van HSP90 expressie en activiteit door verhoogde temperaturen in vitro of in vivo beïnvloedt de stabiliteit en activiteit van transcriptiefactoren zoals de glucocorticoid receptor of de hypoxia-induceerbare factor-1α. De omgevingstemperatuur beïnvloedt aldus de genexpressie in eerste instantie via een directe activering van warmte-induceerbare genen en vervolgens indirect via gewijzigde HSP-expressie en -activiteit.

Volgende vooruitzichten

Volgende studies zijn nodig om de invloed van temperatuursveranderingen in het homeothermische lichaam op de cellulaire functie en genexpressie te bepalen, aangezien in de meeste in vitro studies eenvoudig de kerntemperatuur van het lichaam van 37°C wordt gesimuleerd. Deze temperatuur vertegenwoordigt echter slechts de kern van ons lichaam en veronachtzaamt de dynamische temperatuurveranderingen in andere delen onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Het belang van een nauwkeurige temperatuurregeling bij homeothermen wordt het best geïllustreerd aan de hand van de testis. Zelfs lichte verhogingen van de scrotale temperatuur (die normaal 30-34°C bedraagt) worden in verband gebracht met onvruchtbaarheid. Dit wordt gedeeltelijk toegeschreven aan een hogere expressie van HSP90-eiwitten en p53-gemedieerde celdood, alsook een verminderde expressie van CSP. Dit is waarschijnlijk een van de meest dramatische voorbeelden van de noodzaak van temperatuursaanpassing om onze planeet te “bevruchten”.