La proteina gigante Titin

I gel proteici standard con un contenuto di acrilammide che va dal 6% al 15% sono stati comunemente utilizzati per rilevare le bande proteiche nella gamma da 10 a 200 kD. Poiché questo metodo esclude la rilevazione di proteine più grandi, è stato solo due decenni fa che i ricercatori hanno scoperto una nuova proteina gigantesca con una mobilità apparente estremamente bassa utilizzando gel non convenzionali al 2%. La massa molecolare di questa nuova proteina, la titina1 (indicata anche come connettina2 ), è stata precedentemente stimata tra 1,2 e 3,0 MD (per le recensioni, vedere i riferimenti 3 e 4). Quando l’intensità delle bande di titina su gel SDS viene confrontata con quella di altre proteine miofibrillari, risulta che la titina è, dopo la miosina e l’actina, la terza proteina muscolare più abbondante, costituendo ≈10% del contenuto proteico muscolare combinato. Un adulto umano di 80 kg di peso corporeo può quindi contenere circa mezzo chilo di titina. Considerando la sua abbondanza, la scoperta tardiva della titina è abbastanza sorprendente.

Negli anni ’80, gli studi al microscopio elettronico con anticorpi specifici alla titina avevano dimostrato che la titina è parte integrante della miofibrilla. È stato dimostrato che singole molecole di titina si estendono dal disco Z alla linea M, formando così un terzo sistema di filamenti sarcomerici, oltre ai filamenti spessi (soprattutto miosina) e sottili (soprattutto actina).5 Di conseguenza, le molecole di titina native purificate visualizzate al microscopio elettronico sono risultate lunghe >1 μm.6 Inoltre, queste molecole apparivano come un’asta con una sottostruttura a perline,6 perché le loro catene peptidiche sono composte principalmente da ripetizioni Ig-like e FN3-like,7 che si piegano in domini globulari e rappresentano quasi il 90% della massa della titina (Fig 1). Nella banda A, queste ripetizioni sono disposte in schemi altamente ordinati e aiutano a organizzare la struttura del filamento spesso fornendo siti di legame regolarmente distanziati ad altre proteine della banda A, in particolare la meromiosina leggera e la proteina C (per una revisione, vedi riferimento 15). A causa di una stretta associazione con le proteine del filamento spesso, la parte della banda A della titina è funzionalmente rigida in condizioni fisiologiche. Al contrario, la sezione della banda I della titina è elastica.517 Quando i filamenti di titina vengono estratti dal sarcomero o degradati dalle radiazioni o dalle proteasi, la rigidità della miofibrilla rilassata diminuisce (per una revisione, vedi i riferimenti 3 e 4). Più recentemente, è stato dimostrato che la titina sopporta la maggior parte della tensione a riposo durante le estensioni fisiologiche, sia nel muscolo scheletrico che in quello cardiaco.1819

Approcci a livello molecolare per studiare il ruolo della titina nella struttura e nell’elasticità del muscolo sono diventati più facili dopo la determinazione della sequenza del cDNA delle titine scheletriche e cardiache umane.8 Come suggerito in precedenza dalla diversa mobilità delle titine scheletriche e cardiache su gel SDS,2021 è ora chiaro che la titina è espressa in diverse isoforme in vari tessuti muscolari.8 La titina cardiaca umana, per esempio, è codificata da un mRNA gigante di 82 kb, che contiene un open reading frame di 81 kb che codifica per un peptide di 27 000 residui (Mr, 2993 kD). Al contrario, la titina del soleo umano è un polipeptide significativamente più grande, con una massa molecolare di ≈3700 kD. Queste differenze sono il risultato di una serie di eventi di splicing alternativo della titina della banda I nei diversi tessuti muscolari.8

Elasticità della titina

Quando le fibre muscolari striate rilassate vengono stirate, ne risulta una forza di ritrazione, che viene definita tensione passiva o di riposo (rigidità). È noto da tempo che il muscolo cardiaco è molto più rigido del muscolo scheletrico. In precedenza, si pensava che l’elevata rigidità passiva del tessuto muscolare cardiaco derivasse principalmente dalla bassa conformità delle strutture extracellulari, come il collagene,22 ma con l’avvento della preparazione del singolo miocita,23 è diventato chiaro che le strutture rigide devono essere situate, almeno parzialmente, all’interno della cellula.2425 Gli elementi extracellulari rigidi, che aiutano a prevenire un eccessivo stiramento del tessuto muscolare, possono essere trovati solo a sollecitazioni più estreme. Recentemente, si è potuto anche dimostrare che una forza passiva significativa si sviluppa all’allungamento di singole miofibrille isolate e rilassate, con campioni cardiaci che sono approssimativamente un ordine di grandezza più rigidi dei preparati scheletrici.19 Queste differenze di rigidità sono ora note per derivare dall’espressione specifica per il tipo di muscolo di varianti di lunghezza diversa della titina o, più precisamente, dall’espressione differenziale di due famiglie distinte di motivi della titina nella banda I (Fig 1).813 Un tipo di motivo è rappresentato da domini Ig disposti in tandem. Il muscolo striato più rigido dei vertebrati, il cuore, esprime 40 domini tandem-Ig, mentre il muscolo soleo, molto più flessibile, esprime 93 domini tandem-Ig. L’altro segmento di titina della banda I differenzialmente espresso è un tipo di motivo distinto chiamato dominio PEVK, perché i residui di prolina, glutammato, valina e lisina costituiscono il ≈70% della sua sequenza.8 Questo dominio PEVK è anche il più corto nel cuore e molto più lungo nel muscolo scheletrico: la regione PEVK cardiaca umana comprende 163 residui, mentre la regione PEVK del soleo umano ha ≈2200 residui (Fig 1).8

La scoperta dell’espressione differenziale delle regioni PEVK e tandem-Ig della titina ha reso necessario identificare il contributo relativo di questi due distinti segmenti della banda I all’elasticità della miofibrilla. Tale identificazione è stata recentemente tentata monitorando la posizione di selezionati epitopi anticorpali della banda I della titina in singole miofibrille stirate13 o fibre muscolari,14 oltre a misurare la risposta di tensione passiva dei campioni (Fig 2; confrontare con la referenza 13). È stato suggerito che alla lunghezza allentata del sarcomero, i domini di titina della banda I sono nello stato compatto, mentre un piccolo stiramento può indurre il raddrizzamento delle regioni tandem-Ig.13142728 Questo allungamento iniziale è correlato con un piccolo (muscolo cardiaco) o addirittura trascurabile (muscolo scheletrico) aumento della tensione passiva solo202125 e può quindi non essere portato da unfolding dei moduli tandem-Ig, che hanno dimostrato di ripiegare indipendentemente in domini termodinamicamente stabili.9 A tratti da moderati a lunghi, l’estensione principale sembra avvenire all’interno della regione PEVK, almeno nelle miofibrille scheletriche,1314 mentre la tensione passiva aumenta costantemente (Fig 2). Nelle miofibrille cardiache, la breve regione PEVK8 può anche sostenere la tensione passiva, ma solo in misura limitata (confrontare con la legenda della Fig 2). Una volta che l’estensibilità del segmento PEVK si è esaurita, la tensione passiva potrebbe essere determinata principalmente dal dispiegamento dei domini Ig2728 ; tuttavia, poiché la lunghezza massima dei sarcomeri cardiaci non supera i ≈2,4 μm in vivo, è improbabile che tale dispiegamento si verifichi in condizioni fisiologiche.13

In conclusione, l’elevata estensibilità della regione PEVK durante quantità fisiologiche di allungamento1314 suggerisce che questo dominio è in grado di disfarsi in una catena polipeptidica estesa. Pertanto, la regione PEVK della titina e i domini tandem-Ig possono costituire un sistema a due molle che agiscono in serie. L’espressione tessuto-specifica di entrambe le molle in diverse varianti di lunghezza può ora spiegare perché le proprietà meccaniche passive dei muscoli striati sono così diverse. L’espressione di diverse lunghezze del segmento tandem-Ig in vari tipi di muscoli potrebbe essere importante per impostare la lunghezza fisiologica del sarcomero allentato, mentre lo splicing differenziale delle sequenze ricche di PEVK può controllare la rigidità caratteristica di un tessuto muscolare rilassato. Un compito importante ora è scoprire quale struttura terziaria permette alla regione PEVK della titina di subire i massicci e rapidamente reversibili cambiamenti conformazionali che determinano principalmente la tensione passiva e l’elasticità miofibrillare.

Ruolo emergente della titina nella biologia delle cellule muscolari

Al momento non si sa quale meccanismo di trasduzione del segnale cellulare possa controllare la traduzione, l’assemblaggio, ma anche lo smontaggio e il turnover del polipeptide titina gigante durante la miogenesi e la crescita. La titina contiene centinaia di siti di legame per la miosina, la proteina C e le proteine della linea M715 e probabilmente per un numero significativo di proteine del disco Z e della banda I non ancora identificate. Come fa quindi la cellula muscolare a controllare la traduzione del peptide di titina da 27.000 a 33.000 residui e come può la sintesi di titina essere strettamente accoppiata all’assemblaggio dei ligandi della titina durante la miogenesi? Un modello attraente sarebbe che gli mRNA di titina, miosina e proteina C siano colocalizzati e assemblati in modo cotranslazionale,29 forzando così le catene peptidiche nascenti nel reticolo proteico dell’ordine paracristallino trovato in vivo. Chiaramente, una migliore comprensione di come l’assemblaggio supramolecolare titina/filamento spesso sia in grado di costituire un reticolo tridimensionale altamente ordinato deve ora venire da una caratterizzazione biochimica di frammenti espressi di titina, miosina e proteina C e forse da studi sul metabolismo dell’mRNA della titina.

Un altro meccanismo di controllo dell’assemblaggio dei filamenti di titina potrebbe essere implicito in alcune caratteristiche della sequenza di titina: oltre alla regione PEVK e alle 244-297 copie di ripetizioni strutturali Ig e FN3 (a seconda del tipo di muscolo), la titina contiene anche 19 inserzioni di sequenza uniche, che insieme costituiscono ≈300 kD, o dall’8% al 10%, della massa di titina.8 Due inserzioni di sequenza uniche, situate nelle regioni N-terminale e C-terminale della titina, codificano motivi SP disposti in tandem (Fig 1). I residui di serina nelle ripetizioni SP possono essere fosforilati in vitro da estratti muscolari,3031 e questo potrebbe spiegare perché la titina diventa rapidamente etichettata in vivo quando il fosfato viene iniettato negli animali.32 Forse, vie di fosforilazione/defosforilazione non ancora identificate possono quindi controllare l’assemblaggio del filamento di titina. In futuro, dovrebbe essere interessante indagare le conseguenze funzionali della fosforilazione alle estremità del disco Z e della linea M della titina.

Una delle inserzioni di sequenza unica della titina situata vicino al C-terminale codifica un dominio serina/treonina chinasi (Fig 1).7 Questo dominio e l’organizzazione delle ripetizioni Ig e FN3 che lo affiancano sono molto simili a quelli delle proteine giganti degli invertebrati, twitchin e projectin.3334 Nei domini della chinasi sia della twitchina che della titina sono stati dimostrati siti di legame alla calmodulina.3536 Recentemente, è stato dimostrato che la chinasi della twitchina del mollusco Aplysia è attivata da diversi ordini di grandezza attraverso il cofattore S100, regolato dal calcio.37 Pertanto, sembra probabile che i filamenti della twitchina – e forse anche della titina – rappresentino un nuovo sistema di filamenti sensibili al calcio nel muscolo. Nonostante la crescente comprensione dei fattori che controllano l’attività delle chinasi della titina/twitchina su substrati artificiali, il vero substrato di queste chinasi (e quindi il loro ruolo fisiologico) rimane sconosciuto.

Per comprendere meglio la fisiologia dell’assemblaggio/disassemblaggio della titina a livello molecolare, la scoperta di specifici siti di legame sulla titina per la calpina proteasi, p94,16 potrebbe essere un passo importante (confronta con Fig 1). In contrasto con le calpaine ubiquitarie espresse in tutti i tipi di cellule, la p94 è espressa solo nei tessuti muscolari. Usando la p94 come esca per uno schermo yeast two-hybrid, sono stati identificati due distinti loci che legano la p94 sul filamento di titina.16 Il primo sito si trova nella regione centrale della titina I-band. Probabilmente, la scissione della titina in questo sito da parte di p94 o di proteasi regolate da p94 può spiegare perché la titina si degrada facilmente nella cosiddetta titina T2 (o beta-connectina).3 Quindi, T2 potrebbe essere un prodotto fisiologico di degradazione della titina implicato nel turnover miofibrillare. Inoltre, il secondo sito di legame sulla titina per p94 si trova all’estremità C-terminale del filamento, in coincidenza con l’ultimo inserimento di sequenza unica della titina (Fig 1). Anche se non è chiaro perché almeno due distinti siti di legame per la p94 sono presenti nella titina, una possibilità è che, poiché la p94 solubile è estremamente rapidamente degradabile e ha un’emivita di 30 minuti, i siti di legame alla p94 nella titina possono funzionare per sequestrare la proteasi calpina in uno stato complesso stabilizzato. È interessante notare che il motivo C-terminale di legame a p94 della titina è saltato in alcuni tessuti muscolari a causa dello splicing differenziale38 , il che aggiunge un ulteriore livello di complessità alle interazioni tra p94 e titina e solleva la possibilità di un controllo tessuto-specifico della stabilità della titina.

Aspetti fisiopatologici

Infine, una comprensione molecolare delle interazioni tra il filamento di titina e p94 o altre proteasi calpainiche può ricompensarci con una comprensione più approfondita della degenerazione e rigenerazione muscolare, con particolare riguardo alla situazione fisiopatologica. Un’attenta indagine sulle proteine presenti nelle biopsie muscolari di pazienti normali e distrofici ha rivelato la degradazione della titina nella DMD e nella FCMD.39 Più recentemente, si è scoperto che mutazioni nella calpina proteasi p94, specifica del muscolo, causano la LGMD-2A.40 Dal momento che la titina fornisce siti di legame specifici per p94,16 viene sollevata l’intrigante possibilità che distrofie muscolari geneticamente distinte, come la FCMD, la DMD e la LGMD-2A, condividano una disregolazione dell’interazione p94-titina, che porta poi a una fragilità patologica del sistema dei filamenti di titina come meccanismo patologico comune e secondario.

In sintesi, i filamenti di titina svolgono un ruolo importante sia nel funzionamento fisiologico che fisiopatologico dei muscoli. Mentre una struttura regolare di titina nella banda A sembra essere critica per un assemblaggio ordinato del sarcomero, è chiaro che l’elasticità della titina nella banda I determina le proprietà meccaniche passive della miofibrilla. In futuro, una migliore comprensione molecolare delle proprietà elastiche della titina in banda I potrebbe derivare da un approccio combinato, utilizzando sia tecniche biofisiche che biologiche molecolari. Per quanto riguarda la potenziale attività chinasica della titina e il suo ruolo previsto nella trasduzione del segnale, siamo ancora in attesa di un’esplorazione più dettagliata. Infine, per scoprire ulteriormente il coinvolgimento della titina nei processi fisiopatologici, sarà necessario studiare i moduli di titina espressi per possibili interazioni con altre proteine miofibrillari e citosoliche, caratterizzando così funzionalmente queste interazioni a livello molecolare.

Abbreviazioni e acronimi selezionati

Note