The Giant Protein Titin

Standaard eiwit gels met een acrylamide gehalte varierend van 6% tot 15% zijn gewoonlijk gebruikt om eiwitbanden in het 10- tot 200-kD bereik te detecteren. Aangezien deze methode de detectie van grotere eiwitten uitsluit, ontdekten onderzoekers pas twee decennia geleden een nieuw reusachtig eiwit met een extreem lage schijnbare mobiliteit door gebruik te maken van onconventionele 2%-gels. De molecuulmassa van dit nieuwe eiwit, titine1 (ook wel connectine2 genoemd), werd eerder geschat tussen 1,2 en 3,0 MD (voor overzichten, zie Referenties 3 en 4). Wanneer de intensiteit van titinebanden op SDS-gels wordt vergeleken met die van andere myofibrillaire eiwitten, blijkt dat titine, na myosine en actine, het op twee na meest overvloedige spiereiwit is, dat ≈10% van het gecombineerde spiereiwitgehalte uitmaakt. Een volwassen mens met een lichaamsgewicht van 80 kg kan dus ongeveer een halve kilogram titine bevatten. Gezien zijn overvloed is de late ontdekking van titine nogal verrassend.

In de jaren tachtig hadden elektronenmicroscopische studies met titinespecifieke antilichamen aangetoond dat titine een integraal onderdeel is van de myofibril. Gebleken is dat afzonderlijke titinemoleculen zich uitstrekken van de Z-schijf tot de M-lijn, en zo een derde sarcomeer filamentsysteem vormen, naast de dikke (meestal myosine) en dunne (meestal actine) filamenten.5 Gezuiverde natieve titinemoleculen, gevisualiseerd met elektronenmicroscopie, bleken dan ook >1 μm lang te zijn.6 Bovendien verschenen deze moleculen als een staaf met een kralen substructuur,6 omdat hun peptideketens voornamelijk zijn samengesteld uit Ig-achtige en FN3-achtige herhalingen,7 die zich vouwen tot bolvormige domeinen en bijna 90% van de massa van titine vertegenwoordigen (Fig 1). In de A-band zijn deze herhalingen gerangschikt in zeer geordende patronen en helpen bij het organiseren van de dikke-filament structuur door het bieden van regelmatig verdeelde bindingsplaatsen voor andere A-band eiwitten, met name lichte meromyosine en C-eiwit (voor een overzicht, zie referentie 15). Door de nauwe associatie met de dikke-filament-eiwitten is het A-bandgedeelte van titine onder fysiologische condities functioneel stijf. Het I-band gedeelte van titine is daarentegen elastisch.517 Wanneer titinefilamenten uit het sarcomeer worden verwijderd of door straling of proteasen worden afgebroken, neemt de stijfheid van de ontspannen myofibril af (voor besprekingen, zie Referenties 3 en 4). Meer recent is aangetoond dat titine het grootste deel van de rustspanning draagt tijdens fysiologische extensies, in zowel skelet- als hartspieren.1819

Moleculaire benaderingen om de rol van titine in spierstructuur en elasticiteit te onderzoeken zijn eenvoudiger geworden na de bepaling van de cDNA-sequentie van menselijke skelet- en harttitines.8 Zoals eerder gesuggereerd door de verschillende mobiliteiten van skelet- en cardiale titines op SDS-gels,2021 is het nu duidelijk dat titine in verschillende isovormen in verschillende spierweefsels tot expressie komt.8 Menselijke cardiale titine, bijvoorbeeld, wordt gecodeerd door een reusachtig 82-kb mRNA, dat een 81-kb open leesframe bevat dat codeert voor een peptide van 27 000-residue (Mr, 2993 kD). Menselijke soleus titine daarentegen is een aanzienlijk groter polypeptide, met een molecuulmassa van ≈3700 kD. Deze verschillen zijn het resultaat van een reeks alternatieve splicing events van I-band titine in de verschillende spierweefsels.8

Elasticiteit van Titine

Wanneer ontspannen gestreepte spiervezels worden gestrekt, resulteert dit in een terugtrekkende kracht, die wordt aangeduid als passieve of rustspanning (stijfheid). Het is al lang bekend dat hartspieren veel stijver zijn dan skeletspieren. Eerder werd gedacht dat de hoge passieve stijfheid van hartspierweefsel voornamelijk het gevolg was van de lage therapietrouw van extracellulaire structuren, zoals collageen,22 maar met de komst van het enkelvoudige myocytenpreparaat,23 werd duidelijk dat stijve structuren zich, ten minste gedeeltelijk, binnen de cel moeten bevinden.2425 De stijve extracellulaire elementen, die overstrekking van spierweefsel helpen voorkomen, kunnen alleen bij extremere spanningen worden aangetroffen. Onlangs kon ook worden aangetoond dat aanzienlijke passieve kracht ontstaat bij rek van ontspannen, afzonderlijke, geïsoleerde myofibrillen, waarbij hartmonsters ongeveer een orde van grootte stijver zijn dan skeletpreparaten.19 Van deze verschillen in stijfheid is nu bekend dat ze het gevolg zijn van de spiertype-specifieke expressie van verschillende lengtevarianten van titine of, nauwkeuriger gezegd, van de differentiële expressie van twee verschillende titinemotieffamilies in de I-band (fig. 1).813 Eén motieftype wordt vertegenwoordigd door tandem gerangschikte Ig-domeinen. De stijfste gestreepte spier van vertebraten, het hart, brengt 40 tandem-Ig domeinen tot expressie, terwijl de veel buigzamer soleus spier 93 tandem-Ig domeinen tot expressie brengt. Het andere differentieel tot expressie gebrachte I-band segment van titine is een apart motieftype dat het PEVK-domein wordt genoemd, omdat proline-, glutamaat-, valine- en lysineresten ≈70% van zijn sequentie vormen.8 Dit PEVK domein is ook het kortst in het hart en veel langer in de skeletspieren: de menselijke hart PEVK regio omvat 163 residu’s, terwijl de menselijke soleus PEVK regio ≈2200 residu’s heeft (Fig 1).8

De ontdekking van differentiële expressie van zowel de PEVK als de tandem-Ig regio’s van titine heeft het noodzakelijk gemaakt om de relatieve bijdrage van deze twee verschillende I-band segmenten aan de myofibril elasticiteit te identificeren. Een dergelijke identificatie werd recent gepoogd door de positie van geselecteerde I-band titine antilichaam epitopen te controleren in uitgerekte enkele myofibrillen13 of spiervezels,14 naast het meten van de passieve spanningsrespons van de specimens (Fig 2; vergelijk met Referentie 13 ). Er werd gesuggereerd dat bij een slappe sarcomeerlengte, de I-band titine domeinen zich in de compacte toestand bevinden, terwijl een kleine rek het rechttrekken van de tandem-Ig regio’s kan induceren.13142728 Deze initiële rek is gecorreleerd met een kleine (hartspier) of zelfs verwaarloosbare (skeletspier) passieve spanningstoename alleen202125 en kan dus niet teweeggebracht worden door het ontvouwen van tandem-Ig modules, waarvan is aangetoond dat ze onafhankelijk vouwen tot thermodynamisch stabiele domeinen.9 Bij matige tot lange rek lijkt de belangrijkste uitbreiding plaats te vinden binnen de PEVK regio, althans in skelet myofibrillen,1314 terwijl de passieve spanning gestaag toeneemt (Fig 2). In cardiale myofibrillen kan het korte PEVK-gebied8 ook passieve spanning ondersteunen, maar slechts in beperkte mate (vergelijk met de legende bij Fig 2). Zodra de rekbaarheid van het PEVK segment is uitgeput, zou de passieve spanning hoofdzakelijk kunnen worden bepaald door het ontvouwen van Ig domeinen2728 ; maar aangezien de maximale lengte van cardiale sarcomeren niet langer is dan ≈2.4 μm in vivo, is het onwaarschijnlijk dat een dergelijke ontvouwing onder fysiologische condities optreedt.13

Concluderend, de hoge rekbaarheid van het PEVK gebied gedurende fysiologische hoeveelheden rek1314 suggereert dat dit domein in staat is zich te ontrafelen tot een verlengde polypeptide keten. Daarom kunnen de PEVK regio van titine en de tandem-Ig domeinen een twee-veren systeem vormen dat in serie werkt. De weefselspecifieke expressie van beide veren in verschillende lengtevarianten kan nu verklaren waarom de passieve mechanische eigenschappen van gestreepte spieren zo divers zijn. Expressie van verschillende tandem-Ig segmentlengtes in verschillende spiertypes zou belangrijk kunnen zijn voor het instellen van de fysiologische slappe sarcomeerlengte, terwijl differentiële splicing van PEVK-rijke sequenties de karakteristieke stijfheid van een ontspannen spierweefsel zou kunnen controleren. Een belangrijke taak is nu te ontdekken welke tertiaire structuur de PEVK-regio van titine in staat stelt de massale en snel omkeerbare conformatieveranderingen te ondergaan die in hoofdzaak de myofibrillaire passieve spanning en elasticiteit bepalen.

Ontluikende rollen van titine in de spiercelbiologie

Het is nog onbekend welke cellulaire signaaltransductiemechanismen de translatie, assemblage, en ook de disassemblage en turnover van het reusachtige titinepolypeptide tijdens myogenese en groei kunnen controleren. Titine bevat honderden bindingsplaatsen voor myosine, C-eiwit en M-lijn eiwitten715 en waarschijnlijk ook voor een aanzienlijk aantal nog niet geïdentificeerde Z-schijf en I-band eiwitten. Hoe controleert de spiercel dan de translatie van het 27.000 tot 33.000-residue titine peptide, en hoe kan de titine synthese nauw gekoppeld zijn aan de assemblage van titine liganden tijdens de myogenese? Een aantrekkelijk model zou zijn dat titine, myosine en C-eiwit mRNA’s colokaliseren en cotranslationeel worden geassembleerd,29 waardoor de ontluikende peptideketens in het eiwitmaaswerk van de paracristallijne orde worden gedwongen die in vivo wordt aangetroffen. Het is duidelijk dat een beter begrip van de wijze waarop de supramoleculaire assemblage van titine en dikke filamenten in staat is een sterk geordend driedimensionaal netwerk te vormen, nu moet komen van een biochemische karakterisering van tot expressie gebrachte titine, myosine en C-eiwit fragmenten en misschien van studies van het mRNA metabolisme van titine.

Een ander mechanisme om de assemblage van titine filamenten te controleren zou kunnen worden geïmpliceerd in enkele karakteristieke kenmerken van de titine-sequentie: naast de PEVK-regio en de 244 tot 297 kopieën van Ig en FN3 structurele herhalingen (afhankelijk van het spiertype), bevat titine ook 19 unieke sequentie-invoegingen, die samen ≈300 kD, of 8% tot 10%, van titine’s massa vormen.8 Twee unieke sequentieinserties, gelegen in de N-terminale en C-terminale titine regio’s, coderen tandem gerangschikte SP motieven (Fig 1). De serine residuen in de SP herhalingen kunnen in vitro gefosforyleerd worden door spierextracten,3031 en dit zou kunnen verklaren waarom titine snel gelabeld wordt in vivo wanneer fosfaat geïnjecteerd wordt in dieren.32 Mogelijk kunnen nog niet geïdentificeerde fosforylatie/defosforylatie routes dus de titine filament assemblage controleren. In de toekomst zou het interessant moeten zijn om de functionele gevolgen van fosforylering aan de Z-schijf en M-lijn uiteinden van titine te onderzoeken.

Een van de unieke sequentie invoegingen van titine dicht bij de C-terminus codeert een serine/threonine kinase domein (Fig 1).7 Dit domein en de organisatie van flankerende Ig en FN3 herhalingen zijn zeer vergelijkbaar met die van de reusachtige ongewervelde eiwitten, twitchin en projectin.3334 In de kinase domeinen van zowel twitchine als titine zijn calmoduline bindingsplaatsen aangetoond.3536 Onlangs is aangetoond dat het twitchine kinase van het weekdier Aplysia met meerdere ordes van grootte wordt geactiveerd door de alomtegenwoordige calcium-gereguleerde cofactor S100.37 Het lijkt daarom waarschijnlijk dat de twitchine- en misschien ook de titine-filamenten een nieuw calcium-gevoelig filamenteersysteem in de spier vertegenwoordigen. Ondanks het groeiende inzicht in de factoren die de activiteit van de titine/twitchine kinasen op kunstmatige substraten controleren, blijft het werkelijke substraat van deze kinasen (en daarmee hun fysiologische rol) onbekend.

Om de fysiologie van titine-assemblage/-demontage op moleculair niveau beter te begrijpen, zou de ontdekking van specifieke bindingsplaatsen op titine voor het calpain protease, p94,16 een belangrijke stap kunnen zijn (vergelijk met Fig 1). In tegenstelling tot de alomtegenwoordige calpains uitgedrukt in alle celtypes, wordt p94 alleen uitgedrukt in spierweefsels. Door p94 als lokaas te gebruiken voor een twee-hybrid screening van gist, werden twee verschillende p94-bindende loci geïdentificeerd op het titine filament.16 De eerste locatie bevindt zich in de centrale regio van I-band titine. Mogelijk kan splitsing van titine op deze plaats door p94 of p94-gereguleerde proteasen verklaren waarom titine gemakkelijk degradeert tot het zogenaamde T2 titine (of beta-connectine).3 T2 zou dan een fysiologisch afbraakproduct van titine kunnen zijn dat betrokken is bij myofibrillaire turnover. Bovendien bevindt de tweede bindingsplaats van titine voor p94 zich aan het C-terminale uiteinde van het filament, samenvallend met de laatste unieke sequentie-insertie van titine (Fig 1). Hoewel het onduidelijk is waarom ten minste twee verschillende bindingsplaatsen voor p94 in titine aanwezig zijn, is het mogelijk dat – aangezien het oplosbare p94 zeer snel afbreekbaar is en een halfwaardetijd van 30 minuten heeft – de p94-bindingsplaatsen in titine functioneren om het calpain protease in een gestabiliseerde toestand te sekwestreren. Interessant is dat het C-terminale p94-bindingsmotief van titine in sommige spierweefsels door differentiële splicing wordt overgeslagen,38 wat de interacties tussen p94 en titine nog complexer maakt en de mogelijkheid van een weefselspecifieke controle van de stabiliteit van titine doet ontstaan.

Pathofysiologische aspecten

Ten slotte kan een moleculair begrip van de interacties tussen het titinefilament en p94 of andere calpaine-proteasen ons belonen met een grondiger begrip van spierdegeneratie en -regeneratie, in het bijzonder met betrekking tot de pathofysiologische situatie. Een zorgvuldig onderzoek van de eiwitten aanwezig in spierbiopten van normale en dystrofische patiënten bracht degradatie van titine in DMD en FCMD aan het licht.39 Meer recent werden mutaties in het spier-specifieke calpaine protease p94 gevonden die LGMD-2A veroorzaken.40 Aangezien titine specifieke bindingsplaatsen voor p94 biedt,16 rijst de intrigerende mogelijkheid dat genetisch verschillende spierdystrofieën, zoals FCMD, DMD, en LGMD-2A, een ontregeling van de p94-titine interactie delen, die vervolgens leidt tot een pathologische fragiliteit van het titine filamente systeem als een gemeenschappelijk, secundair ziektemechanisme.

Samenvattend, titine filamenten spelen een belangrijke rol in zowel het fysiologische als pathofysiologische functioneren van spieren. Terwijl een regelmatige titinestructuur in de A band van cruciaal belang lijkt voor een geordende sarcomeeropbouw, is het duidelijk dat de elasticiteit van titine in de I band bepalend is voor de passieve mechanische eigenschappen van de myofibril. In de toekomst zal een beter moleculair begrip van de elastische eigenschappen van titine in de I-band wellicht voortkomen uit een gecombineerde benadering, waarbij zowel biofysische als moleculair-biologische technieken worden gebruikt. Wat betreft de potentiële kinase-activiteit van titine en zijn verwachte rol in signaaltransductie, wachten we nog steeds op meer gedetailleerd onderzoek. Tenslotte, om de betrokkenheid van titine bij pathofysiologische processen verder te ontrafelen, zal het nodig zijn om tot expressie gebrachte titinemodules te bestuderen op mogelijke interacties met andere myofibrillaire en cytosolische eiwitten, waarbij deze interacties functioneel op moleculair niveau worden gekarakteriseerd.

Geselecteerde afkortingen en acroniemen

Footnotes