The Giant Protein Titin

Gel de proteína padrão com um teor de acrilamida entre 6% e 15% têm sido comumente usados para detectar faixas de proteína na faixa de 10- a 200-kD. Como este método exclui a detecção de proteínas maiores, foi apenas há duas décadas que os investigadores descobriram uma nova proteína gigantesca com uma mobilidade aparente extremamente baixa, utilizando géis não convencionais de 2%. A massa molecular dessa nova proteína, titina1 (também chamada de connectin2 ), foi anteriormente estimada entre 1,2 e 3,0 MD (para revisões, veja as Referências 3 e 4). Quando a intensidade das bandas de titina nos géis SDS é comparada com a de outras proteínas miofibrilares, parece que a titina é, depois da miosina e actina, a terceira proteína muscular mais abundante, compondo ≈10% do conteúdo da proteína muscular combinada. Um adulto humano com 80 kg de peso corporal pode assim conter aproximadamente meio quilo de titina. Considerando sua abundância, a descoberta tardia da titina é bastante surpreendente.

Durante os anos 80, estudos microscópicos eletrônicos com anticorpos específicos da titina haviam demonstrado que a titina é parte integrante da miofibril. Foi demonstrado que moléculas únicas de titina se estendem do disco Z até a linha M, formando assim um terceiro sistema de filamentos sarcoméricos, além dos filamentos espessos (principalmente miosina) e finos (principalmente actina).5 Assim, foi descoberto que moléculas nativas de titina purificadas visualizadas por microscopia eletrônica são >1 μm long.6 Além disso, essas moléculas apareceram como uma haste com uma subestrutura com contas,6 porque suas cadeias de peptídeos são compostas principalmente de repetições semelhantes a Ig- e FN3,7 que se dobram em domínios globulares e representam quase 90% da massa da titina (Fig. 1). Na faixa A, essas repetições são organizadas em padrões altamente ordenados e ajudam a organizar a estrutura do filamento grosso, fornecendo locais de ligação regularmente espaçados para outras proteínas da faixa A, notadamente meromiosina leve e proteína C (para revisão, ver referência 15). Devido a uma associação estreita com as proteínas de filamentos espessos, a porção da faixa A da titina é funcionalmente rígida sob condições fisiológicas. Em contraste, a secção da banda I da titina é elástica.517 Quando os filamentos da titina são extraídos do sarcômero ou degradados pela radiação ou proteases, a rigidez da miofibril relaxada diminui (para revisões, ver Referências 3 e 4). Mais recentemente, a titina tem demonstrado suportar a maior parte da tensão de repouso durante extensões fisiológicas, tanto no músculo esquelético quanto no cardíaco.1819

As abordagens a nível molecular para investigar o papel da titina na estrutura muscular e na elasticidade tornaram-se mais fáceis após a determinação da sequência cDNA das titinas esqueléticas e cardíacas humanas.8 Como sugerido anteriormente a partir das diferentes mobilidades das titinas esqueléticas e cardíacas em géis SDS,2021 é agora claro que a titina é expressa em diferentes isoformas em vários tecidos musculares.8 A titina cardíaca humana, por exemplo, é codificada por um mRNA gigante de 82 kb, que contém uma codificação de 81 kb de leitura aberta para um peptídeo de 27 000 resíduos (Mr, 2993 kD). Em contraste, a titina do solado humano é um polipéptido significativamente maior, com uma massa molecular de ≈3700 kD. Estas diferenças são o resultado de uma série de eventos alternativos de emenda da titina da banda I nos diferentes tecidos musculares.8

Elasticidade da Titina

Quando as fibras musculares estriadas relaxadas são esticadas, resulta uma força de retracção, que é referida como tensão passiva ou de repouso (rigidez). Há muito se sabe que o músculo cardíaco é muito mais rígido que o músculo esquelético. Antes, pensava-se que a alta rigidez passiva do tecido muscular cardíaco surgia principalmente da baixa adesão das estruturas extracelulares, como o colágeno,22 mas com o advento da preparação de um único miócito,23 tornou-se claro que as estruturas rígidas devem estar localizadas, pelo menos parcialmente, dentro da célula.2425 Os elementos extracelulares rígidos, que ajudam a evitar o alongamento excessivo do tecido muscular, podem ser encontrados apenas em tensões mais extremas. Recentemente, também pôde ser demonstrado que uma força passiva significativa se desenvolve ao estiramento de miofibrilas relaxadas, únicas e isoladas, sendo as amostras cardíacas aproximadamente uma ordem de magnitude mais rígida do que as preparações esqueléticas.19 Sabe-se agora que essas diferenças de rigidez resultam da expressão específica do tipo muscular de diferentes variantes de comprimento da titina ou, mais precisamente, da expressão diferencial de duas famílias distintas de motivos de titina na banda I (Fig. 1).813. O músculo vertebrado mais rígido, o coração, expressa 40 domínios tandem-Ig, enquanto que o muito mais complacente, o músculo solitário, expressa 93 domínios tandem-Ig. O outro segmento de titina da banda I, expresso de forma diferente, é um tipo de motivo distinto denominado domínio PEVK, porque os resíduos de prolina, glutamato, valina e lisina constituem ≈70% da sua sequência.8 Este domínio PEVK é também o mais curto no coração e muito mais longo no músculo esquelético: a região PEVK cardíaca humana compreende 163 resíduos, enquanto que a região PEVK do solado humano tem ≈2200 resíduos (Fig 1).8

A descoberta da expressão diferencial tanto da PEVK como da região tandem-Ig da titina tornou necessário identificar a contribuição relativa desses dois segmentos distintos da banda I para a elasticidade da miofibril. Tal identificação foi recentemente tentada através da monitorização da posição de epitopos de anticorpos de titina da banda I selecionados em miofibrilas alongadas13 ou fibras musculares,14 além de medir a resposta de tensão passiva dos espécimes (Fig. 2; comparar com a referência 13 ). Foi sugerido que, em comprimento reduzido do sarcômero, os domínios de titina da banda I estão no estado compacto, enquanto que pequenos alongamentos podem induzir o endireitamento das regiões tandem-Ig.13142728 Essa extensão inicial está correlacionada com um pequeno (músculo cardíaco) ou mesmo insignificante (músculo esquelético) aumento da tensão passiva apenas202125 e, portanto, pode não ser provocada pelo desdobramento dos módulos tandem-Ig, que se mostrou dobrar independentemente em domínios termodinamicamente estáveis.9 Em alongamentos moderados a longos, a extensão principal parece ocorrer dentro da região PEVK, pelo menos nas miofibrilas esqueléticas,1314 enquanto a tensão passiva aumenta de forma constante (Fig. 2). Nas miofibrilas cardíacas, a região PEVK curta8 também pode suportar a tensão passiva, mas apenas em grau limitado (compare com a lenda da Fig. 2). Uma vez esgotada a extensibilidade do segmento PEVK, a tensão passiva pode ser determinada principalmente pelo desdobramento dos domínios Ig2728 ; entretanto, como o comprimento máximo dos sarcômeros cardíacos não excede ≈2.4 μm in vivo, é improvável que tal desdobramento ocorra sob condições fisiológicas.13

Em conclusão, a alta extensibilidade da região PEVK durante quantidades fisiológicas de estiramento1314 sugere que este domínio é capaz de se desdobrar para uma cadeia de polipeptídeos estendida. Portanto, a região PEVK da titina e os domínios tandem-Ig podem constituir um sistema de duas molas atuando em série. A expressão específica dos tecidos de ambas as molas em diferentes variantes de comprimento pode agora explicar porque as propriedades mecânicas passivas dos músculos estriados são tão diversas. A expressão de diferentes comprimentos de segmentos tandem-Ig em vários tipos de músculos pode ser importante para definir o comprimento fisiológico do sarcômero frouxo, enquanto a emenda diferencial de seqüências ricas em PEVK pode controlar a rigidez característica de um tecido muscular relaxado. Uma tarefa importante agora é descobrir qual estrutura terciária permite que a região PEVK da titina sofra as mudanças conformacionais maciças e rapidamente reversíveis que determinam principalmente a tensão passiva e elasticidade miofibrilar.

Capítulos Emergentes na Biologia Celular Múscula

No momento, desconhece-se qual a maquinaria de transdução de sinal celular que pode controlar a tradução, montagem, e também a desmontagem e rotação do polipéptido gigante da titina durante a miogênese e crescimento. A titina contém centenas de sítios de ligação para miosina, proteína C, e proteínas da linha M715 e provavelmente para um número significativo de proteínas não identificadas do disco Z e da banda I. Como então a célula muscular controla a tradução do peptídeo de titina de 27 000 a 33 000 resíduos, e como a síntese de titina pode ser estreitamente associada com a montagem de ligandos de titina durante a miogênese? Um modelo atraente seria que a titina, a miosina e os mRNAs de proteína C são colocados e cotraduzidos,29 forçando assim as cadeias de peptídeos nascentes a entrarem na rede de proteínas da ordem paracristalina encontrada in vivo. Claramente, uma melhor compreensão de como a montagem supramolecular de titina/filamento espesso é capaz de constituir uma malha tridimensional altamente ordenada deve agora vir de uma caracterização bioquímica de fragmentos expressos de titina, miosina e proteína C e talvez de estudos do metabolismo do mRNA da titina.

Um outro mecanismo para controlar a montagem do filamento da titina pode estar implícito em algumas características da seqüência de titulação: além da região PEVK e das 244 a 297 cópias de repetições estruturais de Ig e FN3 (dependendo do tipo muscular), a titina também contém 19 inserções de seqüência única, que juntas constituem ≈300 kD, ou 8% a 10% da massa da titina.8 Duas inserções de sequência única, localizadas nas regiões N-terminal e C-terminal da titina, codificam motivos SP dispostos em tandemias (Fig. 1). Os resíduos serinosos nas repetidas SP podem ser fosforilados in vitro por extratos musculares,3031 e isso poderia explicar porque a titina se torna rapidamente rotulada in vivo quando o fosfato é injetado nos animais.32 Possivelmente, as vias de fosforilação/defosforilação ainda não identificadas podem assim controlar a montagem do filamento de titina. No futuro, deve ser interessante investigar as conseqüências funcionais da fosforilação nas extremidades do disco Z e da linha M da titina.

Uma das inserções de sequência única da titina localizada perto do termo C codifica um domínio sereno/trêsonina cinase (Fig. 1).7 Este domínio e a organização das repetições de Ig e FN3 de flanco são muito semelhantes às das proteínas invertebradas gigantes, twitchin e projectin.3334 Nos domínios da cinase, tanto da twitchin como da titina, foram demonstrados locais de ligação de calmodulin.3536 Recentemente, a twitchin kinase do molusco Aplysia foi demonstrada como sendo ativada por várias ordens de magnitude através do onipresente cofator S100 regulado pelo cálcio.37 Portanto, parece provável que a twitchin – e talvez também os filamentos de titina – representem um novo sistema de filamentos sensíveis ao cálcio no músculo. Apesar da crescente compreensão dos fatores que controlam a atividade da titina/desmontagem da titina em substratos artificiais, o substrato genuíno destas kinases (e, portanto, seu papel fisiológico) permanece desconhecido.

Para melhor compreender a fisiologia da montagem/desmontagem da titina a nível molecular, a descoberta de locais específicos de ligação da titina para a protease da calpa, p94,16, pode ser um passo importante (compare com a Fig. 1). Em contraste com as calpaínas ubíquas expressas em todos os tipos celulares, a p94 é expressa apenas nos tecidos musculares. Usando o p94 como isca para uma tela de duas hibridizações de levedura, dois loci distintos de ligação do p94 foram identificados no filamento de titina.16 O primeiro local está localizado na região central da titina da banda I. Possivelmente, a clivagem da titina neste local por proteases p94 ou p94-reguladas pode explicar porque a titina se degrada facilmente para a chamada titina T2 (ou beta-conexão).3 Então, T2 pode ser um produto de decomposição fisiológica da titina implicada no turnover de miofibrilares. Além disso, o segundo local de ligação da titina para a p94 está localizado na extremidade terminal C do filamento, coincidindo com a última sequência única de inserção da titina (Fig. 1). Embora não esteja claro porque pelo menos dois locais de ligação distintos para o p94 estão presentes na titina, uma possibilidade é que – desde que o solúvel p94 seja extremamente rapidamente degradável e tenha uma meia-vida de 30 minutos – os locais de ligação em titina podem funcionar para sequestrar a protease da calpa para um estado estabilizado complexado. Curiosamente, o motivo de ligação C-terminal do p94 à titina é pulado em alguns tecidos musculares por emendas diferenciais,38 o que acrescenta um nível adicional de complexidade às interações entre o p94 e a titina e aumenta a possibilidade de um controle específico do tecido da estabilidade da titina.

Aspecto Patofisiológico

Finalmente, uma compreensão molecular das interações entre o filamento de titina e o p94 ou outras proteases da calpa pode nos recompensar com uma compreensão mais profunda da degeneração e regeneração muscular, com particular respeito à situação fisiopatológica. Uma pesquisa cuidadosa das proteínas presentes nas biópsias musculares de pacientes normais e distróficos revelou degradação da titina em DMD e FCMD.39 Mais recentemente, foram encontradas mutações na calpain protease p94 específicas do músculo que causam LGMD-2A.40 Como a titina fornece sítios de ligação específicos para o p94,16 a intrigante possibilidade de que distrofias musculares geneticamente distintas, tais como FCMD, DMD e LGMD-2A, compartilhem uma desregulação da interação p94-titin, o que então leva a uma fragilidade patológica do sistema de filamentos de titina como um mecanismo comum, secundário, de doença.

Em resumo, filamentos de titina desempenham um papel importante tanto no funcionamento fisiológico quanto fisiopatológico do músculo. Enquanto uma estrutura regular de titina na banda A parece ser crítica para um conjunto ordenado de sarcômeros, é claro que a elasticidade da titina na banda I determina as propriedades mecânicas passivas da miofibril. No futuro, uma melhor compreensão molecular das propriedades elásticas da titina da banda I pode evoluir a partir de uma abordagem combinada, utilizando tanto técnicas biofísicas como biológicas moleculares. Quanto à atividade cinase potencial da titina e seu papel antecipado na transdução de sinal, ainda aguardamos uma exploração mais detalhada. Finalmente, para descobrir ainda mais o envolvimento da titina em processos fisiopatológicos, será necessário estudar módulos de titina expressos para possíveis interações com outras miofibrilares e proteínas citosólicas, caracterizando assim funcionalmente essas interações a nível molecular.

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