熱と細胞、タンパク質について

事実上すべての生化学的プロセスは温度に依存しているので、高等生物は周囲の温度に支配されているというのが通説です。 地球上の極端な気温は、-89.2℃（1983年7月21日、南極ウォストック）から+58℃（1922年9月13日、リビアのアル・アジズヤ）までである。 このような極端な温度差にもかかわらず、ヒトのような恒温動物種は、自律神経系の体温調節機構により、中心体温を37℃までの狭い範囲に調節する能力を有している。 体内温度を比較的一定に保つことができるため、恒温動物は環境温度の変動による影響を受けずに生活することができるようになった。 また、恒温動物では暑さ・寒さに対する顕著な適応が記述されている。 暑熱順化は発汗量を増やすなどして数週間で達成されるが、寒冷順化は何年も寒い環境にさらされることで初めて達成される。 寒冷馴化に関して最もよく研究されているのは、韓国と日本の海女と呼ばれる伝統的な人々である。 10℃の冷たい海水での潜水作業中、直腸温度は37℃から34.8℃の範囲にあることが観察されている(7)。 1960年代初頭に生理学者の洪錫杖が彼女たちを研究したところ、非常に冷たい海に潜る冬季の基礎代謝量は、暖かい季節の観測値よりも著しく高いことがわかった。 このカロリー不足を補うために、食事量は非潜水者に比べて1,000kcalほど増加した。 さらに、水中での震えは、非ダイビングの対照女性と比較して減少した。 しかし、1990年代にHongが研究を繰り返したとき、海士はもはや代謝能力の向上を示さなかった。（幸いなことに）彼らは伝統的な綿の水着で潜るのではなく、寒冷ストレスと戦うためにウェットスーツを提供されたからである

冷血動物、いわゆる恒温動物の中核体温は周囲の温度によって変化する。 恒温動物において、温度は種の分布を支配する最も重要な環境要因である。 水棲動物では、温度の極限状態が実現される。 南極大陸に生息するノトセニア亜目という魚は極端な恒温動物で、南極沿岸の+0.3℃から-1.86℃の低温で熱的に安定している海域に生息している。 1998年には、深海の熱水温が+80℃以上で、体長60℃以上の温度勾配を持つコロニー住性の多毛類ワームAlvinella pompejanaが報告された。

温度変化への適応のシステム的メカニズムはよく知られているが、細胞や遺伝子レベルでの適応はあまり知られていない。 細胞から見た生命は、恒温動物の体内でも高い温度変化を示している（図1）。 日光を浴びた皮膚では、サハラ砂漠の気温に匹敵する+45℃もの温度が測定されることがある。 筋細胞は、働く筋肉の中で40℃まで温度差にさらされている。 偶発的な低体温症や高体温症の場合に生存していた最低・最高芯体温は、それぞれ～30℃と～43℃である。 体温は、哺乳類の体性感覚ニューロン上の冷温受容体を介して全身的に感知される。 これらの受容体はイオンチャネルの一過性受容体電位ファミリーに属しており、温度刺激を電位に変換する。 しかし、細胞レベルでは、各細胞が温度変化に反応してタンパク質の生産を高めたり、減らしたりすることができる。 Sonnaら（15）は、末梢血単核細胞を43℃、20分間曝露した後、チップアレイ法を用いて、227のアップレギュレーション遺伝子と168のダウンレギュレーション遺伝子（調査した12,600のうち）を検出した。 これらのタンパク質のサブセットである熱ショックタンパク質（HSP）は、熱によるダメージから細胞を保護するために特化したタンパク質である。 特異的な熱反応と同様に、各細胞は温度の低下に反応して冷ショックタンパク質（CSP）の産生を増強することができる。

1962年にRitossaはHSPを発見し、その先駆的な仕事をした。 ショウジョウバエの培養液を入れたインキュベーターの温度を上げたところ、幼虫の唾液腺で染色体のパフィングパターン、つまりポリテン染色体の遺伝子活性パターンに顕著な変化が観察されました。 今日、熱、酸化条件、毒性化合物への曝露など、多くのストレスに応答して、すべての細胞が共通のHSPを産生することがよく知られている。 しかし、これらのタンパク質の名前は、その合成を増加させることが確認された最初の引き金（すなわち熱）に由来しています。 HSPの発現増加は、mRNAの合成、mRNAの安定性、翻訳効率など、複数のレベルで媒介されます。 様々な生物種を用いた実験により、これらのタンパク質の発現が増加することで、ストレスによって引き起こされるダメージから生体を守ることができることが示されています。 さらに、致死的でないHSP誘導プレショックを与えた細胞は、その後、致死的な高温にさらされても生き延びることができる。 また、HSPの発現パターンは、異なる生物種間で高いレベルで保存されていることが印象的であった。 このように、熱ショック応答は生物界に普遍的なものであると考えられている。 しかし、寒冷で温度的に安定した環境にさらされた魚の2例（Hydra oligatisとTrematomus bernacchii）では、熱ショック反応は検出されていない。

ヒトでは、中核体温を一定に保つことができるにもかかわらず、環境温度によってHSP発現が変化することを示す例が多数ある。 生体内では運動時に心筋のHSP合成が周囲温度によって増加し、心筋の適応に影響を与えることが観察されている(6)。 白血球におけるHSP72の発現の変化は、環境温度が高い条件下での運動への適応に関連している。 HSPが環境適応に重要であることは、主に恒温動物でよく示されている。 また、これらの研究は、HSP遺伝子が活性化される温度は、季節やその他の平均環境温度の変化に応じて熱順応することも示している。 このように、HSPは細胞の健全性を維持するための一般的なストレス誘導性タンパク質として進化してきたのである(11)。 しかし、この抵抗機構は病態生理で起こるだけでなく、哺乳類の生理学でも適応されている。例えば、ケラチノサイトや腎細胞の浸透圧抵抗性では、生理的浸透圧条件（それぞれ湿度の変化や塩化ナトリウム／尿素の蓄積を介して）でHSPの発現が増強される(2)。

HSPと分子シャペロン

通常の状態（非ストレス）では、分子シャペロンは新しく合成されたタンパク質の折り畳みや区画整理を支援し、また他の様々な細胞機能にも関与しています。 熱ストレスなどのストレス下では、熱によって誘導されたHSPが変性したタンパク質に結合し、凝集を防ぐとともに、室温に戻した後に本来の機能的な状態に再フォールディングするのを助ける。 HSPは、真核細胞では分子量によって分類されています。 現在までに、6つのHSPファミリー（HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40, small HSPs）が同定されています。 グルコース飢餓に伴い、HSPファミリーのいくつかのメンバーの発現が増加することから、これらのタンパク質はグルコース制御タンパク質と呼ばれています。 また、ユビキチンやαB-クリスタリンなど、ストレスタンパク質としての役割とは別に初めて発見されたHSPもあり、それらの名称は特殊である。 表1にシャペロンタンパク質ファミリーの概要とその構造・機能を示す。 特にHSP90とHSP70は非ストレスおよびストレス環境下での細胞機能の維持に重要な役割を担っている。 HSPシャペロンファミリーの概要

HSP90 family

HSP90 は細胞全体のタンパク質量の1〜2％にあたる高度保存タンパク質であり、細胞内では、HSP90は細胞外マトリックスと呼ばれる。 HSP90はタンパク質分解によって同定された3つの構造ドメインから構成されている。 25kDaのNH2-末端領域は、55kDaのCOOH-末端領域と荷電リンカーで結合している。 ATP結合ポケットは2つあり、1つはNH2-末端領域、もう1つはCOOH-末端領域にあることが知られている。 ATPの結合や熱によって、HSP90は2つのNH2-末端ドメインが2量体の中で分離した形から結合した形に切り替わり、トロイダル2量体構造を生成する。 この構造変化が基質結合に関与していると考えられている。 HSP90は、ATP依存性の分子シャペロンとして、ステロイドホルモン受容体、プロテインキナーゼ、転写因子など、未知の多くの基質タンパク質のフォールディングと活性化に関与している(14)。 これらのクライアントタンパク質は、HSP90と複合体を形成することが安定性と機能性の必須条件である。 したがって、HSP90ファミリーに属するシャペロンは、DNA複製、RNA転写、タンパク質フォールディング、成熟、小胞体やミトコンドリア膜を介した輸送、タンパク質分解、細胞シグナル伝達などの細胞内イベントにおけるキープレイヤーであると言えるでしょう。 HSP90は、そのクライアントタンパク質に対して強い特異性を示す。 しかし、HSP90は単独では、既知の基質タンパク質のフォールディングや活性化を促進することができない。 HSP90は、他のHSPやコ・シャペロンと相互作用することによって、完全な活性を発揮する。 プロゲステロン受容体の場合、少なくとも7つのタンパク質（HSP70, Hip, Hop, immunophilins, p23）が追加的に関与している。 プロゲステロン受容体のモデルでは、基質はATPの加水分解を必要としながら、初期複合体（HSP70とHopを含む）、中間複合体（HSP70、Hop、HSP90二量体を含む）、成熟複合体（HSP90二量体とp23）の間で循環していると考えられる。 HSP90が細胞機能に重要であることは、ゲルダナマイシン（GA）のような特異的なHSP90アンタゴニストがHSP90のATP結合ポケットを占有し、HSP90 heterocomplexの循環を防ぐことによって証明されている。 GAで処理した細胞は、細胞成長だけでなく、プロテインキナーゼや転写因子の安定性や活性化にも障害を示す(9)。 HSP90のシャペロン機能が細胞生理に与える意味は、転写因子との相互作用に最もよく表れている。 HSP90は酸素依存性遺伝子発現を担う転写因子、すなわち低酸素誘導因子-1αをシャペロン化するので、GA処理細胞は酸素張力の低下に対する細胞の生理的反応が損なわれる。

HSP70 family

70kDa熱ショック関連タンパク質は、正常時およびストレス状態でのタンパク質フォールディングを制御する高度保存分子シャペロンの一群を構成する (3). HSP70はHSP90と同様に、これらのタンパク質の中で最も多く存在するものの一つで、細胞タンパク質全体の1-2%も占めている。 HSP70は、リボソーム上での新生鎖のフォールディング、膜を介したタンパク質の移動、高温下での保護などを、フォールディングされていないあるいは部分的にフォールディングされたタンパク質の疎水性表面と相互作用することで促進する。 HSP70タンパク質は、NH2-末端のATPaseドメインとCOOH-末端のペプチド結合ドメインの2つのドメインから構成されている。 HSP70のペプチド結合ドメインは、7残基のペプチドをβ-シートサブドメインとα-ヘリカルサブドメインの間に伸長した状態で結合する。 ATPaseドメインにATPが結合すると、ペプチド上に伸びる長いらせんの中央付近の柔軟な接合部でα-domainが上に曲がることにより、基質が放出されるのだと考えられている。 HSP70のコ・シャペロン（Hip、Hop、HSP40、Bag-1など）は、HSP70の活性やタンパク質の基質特異性を調節するのに重要な役割を担っていることが示されている。 Hipは50kDaの細胞質タンパク質で、HSP70ファミリーメンバーのATPaseドメインと相互作用し、基質との相互作用を高めることが見いだされた。 Hopは、様々なシステムにおいて、HSP70とHSP90の両方のシャペロン・マシーナリーと相互作用する能力を持つユニークなコ・シャペロンである。 HSP40とATPがない場合、HSP70はペプチドや変性したタンパク質と優先的に結合する。 しかし、HSP40の存在下では、HSP70はより広い範囲の基質特異性を示すようになる。 Bag-1は、もともとBcl-2関連タンパク質として発見された。 Bag-1は、Bcl-2タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーと相互作用するほか、HSP70と特異的に相互作用することが知られている。 ストレス条件下では、Bag-1-HSP70複合体の形成が増加することが確認された。 HSP70.1やHSP70.3の遺伝子を破壊することで、HSP70が耐熱性の維持や熱によるアポトーシスへの感受性低下に重要であることが明らかになった(8)。 脊椎動物では、これまでに4種類のHSFが同定されている。 複数のHSFが存在することは、HSFの機能的な差異を示唆している。 HSF1およびHSF3とは対照的に、HSF2は古典的なストレス刺激に応答して活性化されることはない。 しかし、HSF1は、高温、硫酸カドミウムやアミノ酸アナログへの曝露などの環境ストレスに応答して、ストレス誘導性、DNA結合、オリゴマー化、核局在化などの典型的な特徴を示す。 遺伝子発現の際、熱ショック遺伝子の転写は、HSF1とすべてのHSP遺伝子のプロモーターに見られる熱ショックエレメントとの相互作用によって行われる。 ストレスのない温度では、HSF1は不活性な単量体タンパク質として細胞質内に存在し、HSP70とHSP90に結合している（図2）。 熱ショック後、HSP70とHSP90は変性したタンパク質と結合するようになり、HSF1から遊離される。 結合していないHSF1は核に局在し、3量体化し、DNA結合能を獲得する。 HSF1はセリン残基でリン酸化され、その後、HSP70やHSP90などのHSP遺伝子が転写活性化される。 その後、新たに合成されたHSP70やHSP90とHSF1との結合が増加し、HSF1の活性が負に制御されます。 したがって、細胞の温度感知は、遊離のHSPとHSF1またはストレスで変性したタンパク質との結合の間の平衡が中心的なプロセスである。 細胞の温度感知 常温下では、熱ショック転写因子1（HSF1）は熱ショックタンパク質70（HSP70）と結合している。 熱にさらされると、HSP70は変性したタンパク質に引き寄せられ、HSF1は抑制されないコンフォメーションで残る。 HSFは3量体化し、リン酸化され、熱誘導性遺伝子のプロモーター領域にある特異的な熱ショック応答要素に結合する。 その後HSP70の産生が増加し、HSF1との結合を介してHSF1活性の負のフィードバック制御をもたらす。

細胞死：アポトーシスとネクローシス

熱に細胞をさらすことにより、適用される温度に応じてアポトーシスやネクローシスを引き起こすことが可能である。 最も興味深いのは、細胞レベルでのアポトーシス誘導の閾値温度が、ヒトの安全許容上限全身中核温度と同等であることである。 ネクローシスを誘導するためには、アポトーシスを誘導する温度よりも高い温度をin vitroで適用する必要がある(10)。 小型HSPや誘導型HSP70の発現は、熱や他のアポトーシスストレス刺激のような多くの種類の刺激にさらされた哺乳類細胞の生存を高めることが示されている(1)。 この抗壊死機能は、特にHSP70とHSP27のシャペロン機能に関連していると考えざるを得ないが、両HSPの抗アポトーシス機能の正確なメカニズムは全くわかっていない。 HSP70がアポトーシス経路と相互作用する可能性は複数あるようだ。 HSP70はApaf-1と相互作用し、それによってプロカスパーゼ-9との相互作用を阻害し、最終的にカスパーゼ依存性のアポトーシスを防ぐと報告されている。 最近、HSP70はアポトーシスの初期にミトコンドリアから放出されるアポトーシス誘導因子と特異的に相互作用し、カスパーゼ非依存的なアポトーシス現象にも関与することが明らかになった。 しかし、CSPと呼ばれる一連のタンパク質は、32℃の温度から高いレベルで発現されるようになる。 低体温は、哺乳類細胞で最初に同定されたCSPであるcold-inducible RNA-binding protein（CIRP）やRNA-binding motif protein 3などのRNA結合性タンパク質の発現を誘導する（4, 12）。 CIRPは、HSPと同様に37℃で発現し、発生的に制御されており、おそらくRNAシャペロンとして働いているのであろう。 哺乳類の32℃での細胞生物学は、例えば精巣や皮膚など、細胞温度が通常30-34℃と〜33℃の場合の生理にかなりの影響を与えると予想される新しい分野である。

HSPは環境温度と細胞機能のリンク

HSPとCSPは進化的に最も保存された温度変化に対する反応である。 これらのタンパク質はずいぶん前に発見され、その分子機能も解明されつつあるが、温度/HSP/CSPを介した作用と細胞機能との関連はあまり調べられていない。 細胞を高温にさらすと、HSPの発現や活性だけでなく、HSPとパートナータンパク質との相互作用にも影響を与える。 例えば、in vitroやin vivoの高温でHSP90の発現や活性が上昇すると、グルココルチコイド受容体や低酸素誘導因子-1αのような転写因子の安定性や活性に影響を与えることが分かっています。 そのため、周囲の温度は、最初は熱誘導性遺伝子の直接的な活性化を介して、その後はHSPの発現や活性の変化を介して間接的に、遺伝子発現に影響を与える。 しかし、この温度は体の中心部のみを表しており、生理的および病態生理学的条件下での他の部分の動的な温度変化を無視している。 恒温動物における正確な温度調節の重要性は、精巣に最もよく表れている。 陰嚢の温度（通常は30-34℃）がわずかに上昇するだけで、不妊症になると言われている。 これは、HSP90タンパク質の発現量の増加、p53を介した細胞死、CSPの発現量の減少が一因であると考えられている。 これは、我々の地球を「肥やす」ために温度適応が必要であることを示す最も劇的な例の一つであろう。

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