Det är allmänt känt att högre former av liv styrs av omgivningstemperaturen, eftersom praktiskt taget alla biokemiska processer är temperaturberoende. De extrema lufttemperaturerna på jorden varierar från -89,2 °C (uppmätt den 21 juli 1983 i Wostock, Antarktis) till +58 °C (uppmätt den 13 september 1922 i Al Azizyah, Libyen). Trots dessa extrema temperaturer har homeoterma arter, som människor, förmågan att reglera sin kroppstemperatur inom ett snävt intervall till 37 °C på grund av autonoma temperaturregleringsmekanismer. Förmågan att upprätthålla en relativt konstant inre temperatur har gjort det möjligt för homeoterma djur att vara oberoende av påverkan från fluktuationer i omgivningstemperaturen. Dessutom beskrivs anmärkningsvärda anpassningar till värme och kyla hos homeotermiska djur. Medan värmeacklimatisering uppnås inom några veckor, t.ex. genom att helt enkelt öka svettningshastigheten, uppnås acklimatisering till kyla först efter flera års exponering i en kall miljö. Den bäst studerade populationen när det gäller acklimatisering till kyla är de traditionella koreanska och japanska dykare som kallas Ama. Under deras dykningsarbete i 10°C kallt havsvatten har rektaltemperaturer på mellan 37°C och 34,8°C observerats (7). När fysiologen Suki Hong studerade dessa kvinnor i början av 1960-talet var deras basala ämnesomsättning under vintermånaderna, när de dök i mycket kallt vatten, betydligt högre än de värden som observerades under varmare månader. För att kompensera detta kaloriunderskott ökade matkonsumtionen med ~1 000 kcal jämfört med icke-dykare. Dessutom minskade rysningsfrekvensen i kallt vatten jämfört med icke-dykande kontrollkvinnor. När Hong upprepade sina studier på 1990-talet uppvisade Ama dock inte längre den ökade metaboliska kapaciteten, eftersom de (lyckligtvis) inte längre dök i sina traditionella bomullsbadkläder utan försågs med våtdräkter för att bekämpa den kalla stressen.
Kroppens kärntemperatur hos kallblodiga djur, de s.k. poikilotermiska djuren, är beroende av den omgivande temperaturen. Hos poikiloterma djur är temperaturen den viktigaste miljöfaktorn som styr arternas utbredning. Extrema temperaturer uppnås hos poikiloterma vattenlevande djur. Antarktisfisken i teleostunderordningen Nototheniodei är en extrem stenoterm som lever i de kalla, termiskt stabila vattnen vid Antarktis kust, där temperaturen varierar från +0,3 °C till -1,86 °C. År 1998 beskrevs den kolonilevande polychaetmasken Alvinella pompejana, som lever i djuphavets hydrotermiska temperaturer över +80°C och har en termisk gradient på 60°C eller mer över sin kroppslängd.
Och även om de systemiska mekanismerna för anpassning till temperaturförändringar är välkända, så vet man mycket mindre om anpassningen på cellulär eller genetisk nivå. Livet, sett ur ett cellperspektiv, uppvisar höga temperaturvariationer även i kropparna hos homeotermer (fig. 1). Temperaturer så höga som +45 °C kan uppmätas på huden vid solexponering, vilket motsvarar temperaturen i Sahara. Myocyter utsätts för temperaturer på upp till 40 °C i den arbetande muskeln. Den lägsta och högsta kroppstemperaturen, som har överlevt vid oavsiktlig hypotermi eller hypertermi, är ~30°C respektive ~43°C. Systematiskt uppfattas temperaturerna via köld- och värmereceptorer på specialiserade somatosensoriska neuroner hos däggdjur. Dessa receptorer tillhör familjen transient receptor potential av jonkanaler, som omvandlar temperaturstimuli till elektriska potentialer. På cellnivå kan dock varje cell reagera på en temperaturförändring med en ökad eller minskad produktion av proteiner. Sonna et al. (15) upptäckte 227 uppreglerade och 168 nedreglerade gener (av 12 600 undersökta) med hjälp av en chip array-metod efter exponering av mononukleära celler från perifert blod för 43 °C i 20 minuter. En undergrupp av dessa proteiner, värmeschockproteinerna (HSP), är specialiserade på att skydda cellerna mot värmeinducerade skador. I likhet med det specifika värmesvaret kan varje cell öka produktionen av kallchockproteiner (CSP) som svar på en temperatursänkning.
FIGUR 1. Översikt över relevanta temperaturer i människans yttre och inre miljö. Den vänstra termometern visar de omgivande temperaturerna i människans biosfär (yttre miljö) och den högra termometern visar temperaturfältet i människokroppen (inre miljö). På den högra sidan av ritningen visas cellulära händelser som har visat sig inträffa vid de angivna temperaturerna in vitro.
I 1962 upptäckte Ritossa HSP:erna i sitt pionjärarbete. Efter en höjning av temperaturen i en inkubator med Drosophila-kulturer observerade han anmärkningsvärda förändringar i de kromosomala puffmönstren, dvs. genaktivitetsmönstren hos de polytena kromosomerna i larvernas salivkörtlar. I dag är det välkänt att alla celler producerar en gemensam uppsättning HSP:er som svar på många påfrestningar, inklusive värme, oxiderande förhållanden och exponering för giftiga föreningar. Namnet på dessa proteiner härrör dock från den första utlösande faktor (dvs. värme) som identifierades som en ökning av deras syntes. Ökat uttryck av HSPs förmedlas på flera nivåer: mRNA-syntes, mRNA-stabilitet och översättningseffektivitet. Försök med olika arter har visat att ett ökat uttryck av dessa proteiner kan skydda organismen mot stressinducerade skador. Dessutom överlever celler som fått en icke-dödlig HSP-inducerande förchock senare en annars dödlig exponering för förhöjda temperaturer. Det är slående att uttrycksmönstren för HSP:erna uppvisar höga nivåer av bevarande bland de olika arterna. Hettchockreaktionen tros därför vara praktiskt taget universell bland organismerna. I två fall av fiskar som utsätts för kalla, termiskt stabila miljöer (Hydra oligatis och Trematomus bernacchii) har dock ingen värmeschockreaktion upptäckts.
Det finns många exempel som visar att HSP-uttrycket kan variera med omgivningstemperaturen hos människor trots att de har förmågan att upprätthålla en konstant kroppstemperatur. Ökad HSP-syntes har observerats in vivo under träning i hjärtmuskeln beroende på omgivningstemperaturen som påverkar myokardiella anpassningar (6). Förändringar i HSP72-uttrycket i leukocyter är förknippade med anpassning till träning under förhållanden med hög omgivningstemperatur. HSP:s betydelse för systemisk miljöanpassning är väl påvisad främst hos poikilotermiska djur. Dessa studier visar också att den temperatur vid vilken HSP-generna aktiveras är föremål för termisk acklimatisering som en funktion av säsong eller andra förändringar i den genomsnittliga miljötemperaturen. Sammantaget har HSP utvecklats som allmänna stressinducerbara proteiner för att upprätthålla den cellulära integriteten (11). Denna motståndsmekanism äger dock inte bara rum i patofysiologiska situationer utan är också anpassad i däggdjurens fysiologi, till exempel vid osmotisk resistens hos keratinocyter eller njurceller, där fysiologiska osmotiska förhållanden (via förändring av luftfuktighet eller ackumulering av natriumklorid/urea respektive) resulterar i ett ökat uttryck av HSPs (2).
HSP:er och molekylära chaperoner
Under normala (icke stressiga) förhållanden hjälper molekylära chaperoner till med rutinmässig veckning och kompartmentering av nysyntetiserade proteiner, och de deltar också i en rad andra cellulära funktioner. Under termiska eller andra former av stress binder värmeinducerade HSP:er till denaturerade proteiner och förhindrar därmed deras aggregering och hjälper dem att återveckas till ursprungliga, funktionella tillstånd efter återställande av omgivningstemperaturen. HSPs har klassificerats i eukaryota celler efter deras molekylvikt. Hittills har sex HSP-familjer identifierats (HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40 och de små HSP:erna). Eftersom uttrycket av vissa medlemmar av HSP-familjerna ökar vid glukoshunger kallas dessa proteiner för glukosreglerade proteiner. Vissa HSP:er som först upptäcktes oberoende av deras roll som stressproteiner (som ubiquitin eller αB-kristallin) bär sina särskilda namn. En översikt över chaperonproteinfamiljerna och deras struktur och funktion ges i tabell 1. Särskilt HSP90 och HSP70 spelar en viktig roll när det gäller att upprätthålla cellfunktionen under icke-stress- och stressförhållanden.
TABELL 1. Översikt över HSP-chaperonfamiljer
HSP, heat shock protein; sHSP, small HSP; bHLH, basic helix loop helix.
HSP90-familjen
HSP90 är mycket konserverade proteiner som utgör 1-2 % av hela cellens proteininnehåll. HSP90 består av tre strukturella domäner som identifierats genom proteolytisk digestion. Den ~25 kDa NH2-terminala domänen är kopplad till en mycket konserverad ~55 kDa COOH-terminal region genom en laddad länk, som varierar i längd och sammansättning mellan arter och isoformer. Två ATP-bindningsfickor har beskrivits, en i den NH2-terminala och en i den COOH-terminala regionen. Vid ATP-bindning eller värme växlar HSP90 från en form där de två NH2-terminala domänerna är separerade i dimern till en form där de är associerade, vilket genererar en toroidal dimerstruktur. Denna konformationsförändring tros vara ansvarig för substratbindning. HSP90 fungerar som en ATP-beroende molekylär chaperon som är involverad i veckningen och aktiveringen av ett okänt antal substratproteiner, inklusive steroidhormonreceptorer, proteinkinaser och transkriptionsfaktorer (14). Komplexbildningen av dessa klientproteiner med HSP90 är en förutsättning för deras stabilitet och funktionalitet. Därför är chaperoner som tillhör HSP90-familjen nyckelaktörer i cellulära händelser, t.ex. DNA-replikation, RNA-transkription, proteinveckning, mognad, translokation genom det endoplasmatiska retikulumet och mitokondriemembranen, proteolys och cellsignalering. HSP90 uppvisar en stark specificitet för sina klientproteiner. HSP90 kan dock inte ensamt främja veckning och/eller aktivering av något av sina kända substratproteiner. För full aktivitet krävs ett samspel mellan HSP90 och andra HSP:er och co-chaperoner. När det gäller progesteronreceptorn är minst sju ytterligare proteiner inblandade (HSP70, Hip, Hop, immunofiliner och p23). På grundval av progesteronreceptormodellen cyklar substratet mellan ett tidigt komplex (som innehåller HSP70 och Hop), ett intermediärt komplex (som innehåller HSP70, Hop och en HSP90-dimer) och det mogna komplexet (som innehåller en HSP90-dimer och p23) med nödvändighet av ATP-hydrolys. HSP90:s betydelse för cellfunktioner visas genom användning av specifika HSP90-antagonister som geldanamycin (GA) som ockuperar HSP90:s ATP-bindningsficka och därmed förhindrar att HSP90-heterokomplexet cyklar. GA-behandlade celler uppvisar brister i celltillväxt samt i stabilitet och aktivering av proteinkinaser och transkriptionsfaktorer (9). Betydelsen av HSP90-chaperonfunktionen för cellfysiologin exemplifieras bäst av dess interaktion med transkriptionsfaktorer. Eftersom HSP90 chaperonerar transkriptionsfaktorn som ansvarar för syreberoende genuttryck, dvs. den hypoxiinducerbara faktorn-1α, är GA-behandlade celler nedsatta i cellernas fysiologiska svar på en minskad syretryckspänning.
HSP70-familjen
Den 70-kDa värmeskocksrelaterade proteinerna utgör en familj av högt bevarade molekylära chaperoner som reglerar proteinveckningen under normala och stressförhållanden (3). HSP70, liksom HSP90, är ett av de mest förekommande av dessa proteiner och utgör så mycket som 1-2 % av det totala cellulära proteinet. HSP70-proteiner främjar veckningen av begynnande kedjor på ribosomer, translokation av proteiner genom membran och skydd vid höga temperaturer genom interaktion med exponerade hydrofoba ytor hos oveckade eller delvis veckade proteiner. HSP70-proteiner innehåller två domäner, en NH2-terminal ATPase-domän och en COOH-terminal peptidbindande domän. HSP70:s peptidbindande domän binder en peptid med sju resider i en förlängd konformation mellan en β-bladunderdomän och en α-helikal underdomän. Man tror att ATP-bindning till ATPas-domänen utlöser substratfrisättning genom att α-domänen böjs uppåt vid en flexibel korsning nära mitten av den långa helixen som sträcker sig över peptiden. HSP70 co-chaperoner, såsom Hip, Hop, HSP40 och Bag-1, har visat sig spela en viktig roll för att modulera HSP70-aktiviteten samt proteinsubstratspecificiteten. Hip är ett cytosoliskt 50 kDa-protein som visade sig interagera med ATPasdomänen hos HSP70-familjemedlemmar och förstärka substratinteraktionen. Hop är en unik co-chaperon som har förmågan att interagera med både HSP70- och HSP90-chaperonmaskineriet i olika system. I avsaknad av HSP40 och ATP binder HSP70 företrädesvis till peptider och denaturerat protein. I närvaro av HSP40 uppvisar HSP70 dock ett bredare spektrum av substratspecificitet. Bag-1 upptäcktes ursprungligen som ett Bcl-2-associerat protein. Förutom sin interaktion med antiapoptotiska medlemmar av Bcl-2-proteinfamiljen interagerar Bag-1 också specifikt med HSP70. Under stressförhållanden kan man konstatera en ökad bildning av Bag-1-HSP70-komplex. Generering av riktade genavbrott av genen HSP70.1 eller HSP70.3 understryker betydelsen av HSP70 för att upprätthålla förvärvad termotolerans och minskad känslighet för värmeinducerad apoptos (8).
HSP: den cellulära termometern
Det inducerbara HSP-uttrycket regleras av värmeschocktranskriptionsfaktorerna (HSF) (13). Hos ryggradsdjur har fyra olika HSF hittills identifierats. Förekomsten av flera HSF:er tyder på funktionella skillnader mellan HSF:erna. Till skillnad från HSF1 och HSF3 aktiveras HSF2 inte som svar på klassiska stresstimuli. HSF1 uppvisar dock de typiska egenskaperna för stressinducerbarhet, DNA-bindning, oligomerisering och nukleär lokalisering som svar på miljöstressorer såsom förhöjda temperaturer och exponering för kadmiumsulfat och aminosyraanaloger. Under genuttrycket medieras transaktiveringen av värmeschockgener av interaktionen mellan HSF1 och det värmeschockelement som finns i promotorn för alla HSP-gener. Vid icke stressiga temperaturer finns HSF1 i cytosolen som ett inaktivt, monomeriskt protein som är bundet av HSP70 och HSP90 (fig. 2). Efter en värmeschock rekryteras HSP70 och HSP90 för att binda denaturerade proteiner och frigörs därmed från HSF1. Det obundna HSF1 lokaliseras till kärnan, trimeriseras och får DNA-bindningsförmåga. HSF1 fosforyleras vid serinrester, följt av transaktivering av HSP-gener, inklusive HSP70 och HSP90. Därefter regleras HSF1:s aktivitet negativt genom ökad bindning av de nysyntetiserade HSP70 och HSP90 till HSF1. Den centrala processen för cellulär temperaturavkänning är därför jämvikten mellan bindningen av fria HSP:er till HSF1 eller till stressdenaturerade proteiner.
FIGUR 2. Cellulär temperaturavkänning. Under normoterma temperaturer är värmeschocktranskriptionsfaktor 1 (HSF1) bunden till värmeschockprotein 70 (HSP70). Efter värmeexponering rekryteras HSP70 till denaturerade proteiner och lämnar HSF1 i en icke-repressad konformation. HSF trimeriseras, blir fosforylerad och binder till specifika värmechocksresponselement i promotorregionen för värmeinducerbara gener. Den efterföljande ökade produktionen av HSP70 leder till en negativ återkopplingsreglering av HSF1-aktiviteten via bindning av HSF1.
Celldöd: apoptos och nekros
Exponering av celler för värme kan resultera i apoptos eller nekros beroende på vilken temperatur som tillämpas. Det mest intressanta är att tröskeltemperaturen för apoptosinduktion på cellnivå är likvärdig med den övre tröskel för systemisk kärntemperatur som kan tolereras på ett säkert sätt hos människor. För att inducera nekros måste högre temperaturer än de som inducerar apoptos tillämpas in vitro (10). Uttryck av små HSP:er eller den inducerbara HSP70 har visat sig öka överlevnaden hos däggdjursceller som utsätts för många typer av stimuli, som värme eller andra former av apoptotisk stress (1). Även om man måste anta att den antinekrotiska funktionen är kopplad till chaperonfunktionen, särskilt hos HSP70 och HSP27, är den exakta mekanismen för den antiapoptotiska funktionen hos de båda HSP:erna inte helt klar. Det verkar finnas flera möjligheter för HSP70 att interagera med apoptotiska vägar. Enligt uppgift interagerar HSP70 med Apaf-1 och förhindrar därmed dess interaktion med procaspase-9 och slutligen caspasberoende apoptos. Nyligen har det visats att HSP70 också deltar i caspasoberoende apoptotiska händelser via specifik interaktion med den apoptosinducerande faktorn, som frigörs från mitokondrier tidigt i den apoptotiska processen.
Köldchocksvaret
Köldstress förändrar lipidsammansättningen i cellmembranen och undertrycker proteinsyntesens och cellproliferationens hastighet. En uppsättning proteiner som kallas CSP uttrycks dock på högre nivåer från och med en temperatur på 32°C. Hypotermi inducerar uttrycket av RNA-bindande proteiner som cold-inducible RNA-binding protein (CIRP), det första CSP som identifierats i däggdjursceller, och RNA-bindande motivprotein 3 (4, 12). CIRP, som påminner om HSP, uttrycks också vid 37 °C och regleras utvecklingsmässigt, och fungerar möjligen som en RNA-chaperon. Cellulär och molekylär biologi av däggdjursceller vid 32 °C är ett nytt område som förväntas få betydande konsekvenser för fysiologin, till exempel i testiklar och hud, där celltemperaturen vanligtvis är 30-34 °C respektive ~33 °C.
HSP:erna är länken mellan omgivningstemperaturen och den cellulära funktionen
HSP:erna och CSP:erna är evolutionärt sett det mest bevarade svaret på temperaturförändringar. Även om proteinerna upptäcktes för länge sedan och dessa proteiners molekylära funktioner förstås mer och mer, är kopplingen mellan temperatur/HSP/CSP-medierade effekter och cellfunktioner mindre utforskad. Att utsätta celler för förhöjda temperaturer påverkar inte bara HSP-uttryck och -aktivitet utan även HSP:s interaktion med partnerproteiner. Till exempel påverkar ett ökat HSP90-uttryck och en ökad HSP90-aktivitet genom förhöjda temperaturer in vitro eller in vivo stabiliteten och aktiviteten hos transkriptionsfaktorer som glukokortikoidreceptorn eller den hypoxiinducerbara faktorn-1α. Omgivningstemperaturen påverkar därmed genuttrycket först via en direkt aktivering av värmeinducerbara gener och därefter indirekt via förändrat HSP-uttryck och aktivitet.
Framtida utsikter
Det behövs ytterligare studier för att fastställa hur temperaturförändringar i den homeoterma kroppen påverkar cellfunktionen och genuttrycket, eftersom man i de flesta in vitro-studier helt enkelt simulerar kroppens kärntemperatur på 37°C. Denna temperatur representerar dock bara kärnan i vår kropp och försummar de dynamiska temperaturförändringarna i andra delar under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Betydelsen av exakt temperaturreglering hos homeotermer exemplifieras bäst i testiklarna. Även små förhöjningar av temperaturen i pungen (som normalt är 30-34 °C) är förknippade med infertilitet. Detta kan delvis tillskrivas högre uttryck av HSP90-proteiner och p53-medierad celldöd samt minskat CSP-uttryck. Detta är förmodligen ett av de mest dramatiska exemplen på behovet av temperaturanpassning för att ”befrukta” vår planet.
- 1 Arrigo AP. sHsp as novel regulators of programmed cell death and tumorigenicity. Pathol Biol (Paris) 48: 280-288, 2000.
PubMed | ISI | Google Scholar - 2 Beck FX, Grunbein R, Lugmayr K och Neuhofer W. Heat shock proteins and the cellular response to osmotic stress. Cell Physiol Biochem 10: 303-306, 2000.
Crossref | PubMed | ISI | Google Scholar - 3 Boorstein WR, Ziegelhoffer T och Craig EA. Molekylär utveckling av HSP70-multigenfamiljen. J Mol Evol 38: 1-17, 1994.
Crossref | PubMed | ISI | Google Scholar - 4 Danno S, Nishiyama H, Higashitsuji H, Yokoi H, Xue JH, Itoh K, Matsuda T och Fujita J. Ökad transkriptnivå av RBM3, en medlem av familjen glycinrika RNA-bindande protein, i mänskliga celler som svar på köldstress. Biochem Biophys Res Commun 236: 804-807, 1997.
Crossref | PubMed | ISI | Google Scholar - 6 Harris MB och Starnes JW. Effekter av kroppstemperatur under träning på myokardiska anpassningar. Am J Physiol Heart Circ Physiol 280: H2271-H2280, 2001.
Link | ISI | Google Scholar - 7 Hong SK, Lee CK, Kim JK, Song SH och Kennie DW. Perifert blodflöde och värmeflöde hos koreanska kvinnliga dykare. Fed Proc 28: 1143-1148, 1969.
Google Scholar - 8 Huang L, Mivechi NF och Moskophidis D. Insights into regulation and function of the major stress-induced hsp70 molecular chaperone in vivo: analysis of mice with targeted gene disruption of the hsp70.1 or hsp70.3 gene. Mol Cell Biol 21: 8575-8591, 2001.
Crossref | PubMed | ISI | Google Scholar - 9 Katschinski DM, Le L, Heinrich D, Wagner KF, Hofer T, Schindler SG och Wenger RH. Värmeinduktion av den ofosforylerade formen av hypoxiinducerbar faktor-1a är beroende av värmechockprotein-90-aktivitet. J Biol Chem 4: 9262-9267, 2002.
Google Scholar - 10 Katschinski DM, Robins HI, Schad M, Frede S och Fandrey J. Role of tumor necrosis factor alpha in hyperthermia-induced apoptosis of human leukemia cells. Cancer Res 59: 3404-3410, 1999.
PubMed | ISI | Google Scholar - 11 Moseley PL. Värmechockproteiner och hela organismens värmeanpassning. J Appl Physiol 83: 1413-1417, 1997.
Link | ISI | Google Scholar - 12 Nishiyama H, Higashitsuji H, Yokoi H, Itoh K, Danno S, Matsuda T och Fujita J. Cloning and characterization of human CIRP (cold-inducible RNA-binding protein) cDNA and chromosomal assignment of the gene. Gene 204: 115-120, 1997.
Crossref | PubMed | ISI | Google Scholar - 13 Pirkkala L, Nykanen P, and Sistonen L. Roles of the heat shock transcription factors in regulation of the heat shock response and beyond. FASEB J 15: 1118-1131, 2001.
Crossref | PubMed | ISI | Google Scholar - 14 Richter K och Buchner J. Hsp90: chaperoning signal transduction. J Cell Physiol 188: 281-290, 2001.
Crossref | PubMed | ISI | Google Scholar - 15 Sonna LA, Fujita J, Gaffin SL och Lilly CM. Inbjuden recension: Effekter av värme- och köldstress på däggdjurs genuttryck. J Appl Physiol 92: 1725-1742, 2002.
Link | ISI | Google Scholar