O cieple i komórkach i białkach

Przyjęta mądrość mówi, że wyższe formy życia są rządzone przez temperaturę otoczenia, ponieważ praktycznie wszystkie procesy biochemiczne są zależne od temperatury. Ekstremalne temperatury powietrza na Ziemi wahają się od -89.2°C (zmierzona 21 lipca 1983, Wostock, Antarktyda) do +58°C (zmierzona 13 września 1922, Al Azizyah, Libia). Pomimo tych ekstremalnych temperatur, gatunki homeotermiczne, takie jak ludzie, mają zdolność do regulowania temperatury ciała w wąskim zakresie do 37°C dzięki autonomicznym mechanizmom regulacji temperatury. Zdolność do utrzymywania względnie stałej temperatury wewnętrznej pozwoliła zwierzętom homeotermicznym uniezależnić się od wpływu wahań temperatury otoczenia. Ponadto, u homeotermów opisano niezwykłe adaptacje do ciepła i zimna. Podczas gdy aklimatyzacja do ciepła osiągana jest w ciągu kilku tygodni, na przykład poprzez zwykłe zwiększenie ilości wydzielanego potu, aklimatyzacja do zimna osiągana jest dopiero po wieloletniej ekspozycji na zimne środowisko. Najlepiej przebadaną populacją pod względem aklimatyzacji do zimna są tradycyjni koreańscy i japońscy nurkowie zwani Ama. Podczas nurkowania w zimnej o 10°C wodzie morskiej obserwowano u nich temperatury w odbycie od 37°C do 34,8°C (7). Kiedy fizjolog Suki Hong badała te kobiety na początku lat 60-tych, ich podstawowa przemiana materii w miesiącach zimowych, kiedy nurkowały w bardzo zimnej wodzie, była znacznie podwyższona w stosunku do wartości obserwowanych w cieplejszych miesiącach. Aby zrekompensować ten deficyt kaloryczny, spożycie żywności wzrosło o ~1,000 kcal w porównaniu z osobami nienurkującymi. Dodatkowo, częstość występowania dreszczy w zimnej wodzie była zmniejszona w porównaniu do nienurkujących kobiet z grupy kontrolnej. Jednakże, kiedy Hong powtórzył swoje badania w latach 90-tych, Ama nie wykazywały już zwiększonej zdolności metabolicznej, ponieważ (na szczęście) nie nurkowały już w tradycyjnych bawełnianych kostiumach kąpielowych, ale były wyposażone w mokre kombinezony do walki z zimnym stresem.

Temperatura ciała zwierząt zimnokrwistych, tzw. zwierząt poikilotermicznych, zależy od temperatury otoczenia. U zwierząt poikilotermicznych temperatura jest najważniejszym czynnikiem środowiskowym regulującym rozmieszczenie gatunków. Ekstrema temperaturowe osiągane są u poikilotermicznych zwierząt wodnych. Antarktyczna ryba z podrzędu teleostów Nototheniodei jest ekstremalną stenotermią, która żyje w zimnych, stabilnych termicznie wodach przybrzeżnej Antarktydy, gdzie temperatury wahają się od +0,3°C do -1,86°C. W 1998 roku opisano żyjącego w kolonii wieloszczetów robaka Alvinella pompejana, zamieszkującego głębinowe hydrotermalne temperatury powyżej +80°C i posiadającego gradient termiczny 60°C lub więcej na długości ciała.

Ale chociaż systemowe mechanizmy adaptacji do zmian temperatury są dobrze znane, znacznie mniej wiadomo o adaptacji na poziomie komórkowym lub genetycznym. Życie, widziane z perspektywy komórkowej, wykazuje duże wahania temperatury nawet w ciałach homeotermów (ryc. 1). Podczas ekspozycji na słońce na skórze można zmierzyć temperatury sięgające +45°C, co odpowiada temperaturze panującej na Saharze. W pracujących mięśniach miocyty narażone są na temperatury dochodzące do 40°C. Najniższa i najwyższa temperatura rdzenia ciała, którą udało się przeżyć w przypadkach przypadkowej hipotermii lub hipertermii, wynosi odpowiednio ~30°C i ~43°C. Ogólnoustrojowe odczuwanie temperatury odbywa się za pośrednictwem receptorów zimna i ciepła na wyspecjalizowanych neuronach somatosensorycznych ssaków. Receptory te należą do rodziny kanałów jonowych typu transient receptor potential, które przekształcają bodźce temperaturowe w potencjały elektryczne. Na poziomie komórkowym natomiast każda komórka jest w stanie zareagować na zmianę temperatury zwiększoną lub zmniejszoną produkcją białek. Sonna i wsp. (15) wykryli 227 genów o podwyższonej i 168 o obniżonej regulacji (z 12 600 badanych), stosując metodę chip array po ekspozycji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na 43°C przez 20 min. Podzbiór tych białek, białka szoku cieplnego (HSP), są wyspecjalizowane w ochronie komórek przed uszkodzeniami wywołanymi przez ciepło. Podobnie jak w przypadku specyficznej odpowiedzi na ciepło, każda komórka jest zdolna do zwiększonej produkcji białek szoku zimna (CSP) w odpowiedzi na obniżenie temperatury.

W 1962 roku Ritossa odkrył HSPs w swojej pionierskiej pracy. Po podwyższeniu temperatury w inkubatorze z hodowlami Drosophila, zaobserwował on niezwykłe zmiany we wzorcach puffingu chromosomalnego, czyli wzorcach aktywności genów w chromosomach poligenowych w larwalnych gruczołach ślinowych. Dzisiaj wiadomo, że w odpowiedzi na wiele stresów, w tym ciepło, warunki utleniające i ekspozycję na związki toksyczne, wszystkie komórki produkują wspólny zestaw HSPs. Nazwa tych białek pochodzi jednak od pierwszego czynnika wyzwalającego (tj. ciepła), który został zidentyfikowany jako zwiększający ich syntezę. Zwiększona ekspresja HSPs zachodzi na wielu poziomach: syntezy mRNA, stabilności mRNA i wydajności translacji. Eksperymenty na różnych gatunkach zwierząt wykazały, że zwiększona ekspresja tych białek może chronić organizm przed uszkodzeniami wywołanymi stresem. Co więcej, komórki poddane nieśmiertelnemu wstrząsowi wstępnemu indukującemu HSP przeżywają następnie śmiertelną ekspozycję na podwyższoną temperaturę. Uderzające jest to, że wzorce ekspresji HSPs wykazują wysoki poziom zachowania wśród różnych gatunków. Dlatego uważa się, że odpowiedź na szok cieplny jest praktycznie uniwersalna wśród organizmów. Jednak w dwóch przypadkach ryb narażonych na zimne, stabilne termicznie środowiska (Hydra oligatis i Trematomus bernacchii), nie wykryto odpowiedzi na szok cieplny.

Liczne przykłady pokazują, że ekspresja HSP może się zmieniać w zależności od temperatury środowiska u ludzi, pomimo ich zdolności do utrzymywania stałej temperatury ciała. Zwiększona synteza HSP została zaobserwowana in vivo podczas ćwiczeń w mięśniu sercowym w zależności od temperatury otoczenia wpływającej na adaptacje mięśnia sercowego (6). Zmiany w ekspresji HSP72 w leukocytach związane są z adaptacją do wysiłku w warunkach wysokiej temperatury otoczenia. Znaczenie HSPs w środowiskowej adaptacji ogólnoustrojowej jest dobrze poznane głównie u zwierząt poikilotermicznych. Badania te wykazały również, że temperatura, w której następuje aktywacja genów HSP podlega aklimatyzacji termicznej w zależności od pory roku lub innych zmian średniej temperatury środowiska. Łącznie, HSPs ewoluowały jako ogólne białka indukowane stresem w celu utrzymania integralności komórkowej (11). Ten mechanizm odporności ma jednak miejsce nie tylko w sytuacjach patofizjologicznych, ale jest również dostosowany w fizjologii ssaków, na przykład w odporności osmotycznej keratynocytów lub komórek nerek, gdzie fizjologiczne warunki osmotyczne (poprzez zmianę wilgotności lub akumulację chlorku sodu/mocznika, odpowiednio) powodują zwiększoną ekspresję HSPs (2).

HSP i chaperony molekularne

W normalnych (niestresowych) warunkach chaperony molekularne pomagają w rutynowym składaniu i kompartmentalizacji nowo zsyntetyzowanych białek, a także biorą udział w wielu innych funkcjach komórkowych. Podczas stresu termicznego lub innych form stresu, indukowane ciepłem HSP wiążą się do zdenaturowanych białek, zapobiegając w ten sposób ich agregacji i pomagając w ich ponownym składaniu do natywnych, funkcjonalnych stanów po przywróceniu temperatury otoczenia. HSPs zostały sklasyfikowane w komórkach eukariotycznych według ich masy cząsteczkowej. Do tej pory zidentyfikowano sześć rodzin HSP (HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40 i małe HSP). Ponieważ ekspresja niektórych członków rodzin HSP jest zwiększona podczas głodzenia glukozą, białka te nazywane są białkami regulowanymi przez glukozę. Niektóre HSP, odkryte po raz pierwszy niezależnie od ich roli jako białek stresu (jak ubikwityna czy αB-krystalina), noszą swoje szczególne nazwy. Przegląd rodzin białek chaperonowych oraz ich struktury i funkcji przedstawiono w tabeli 1. W szczególności HSP90 i HSP70 odgrywają ważną rolę w utrzymaniu funkcji komórki w warunkach niestresowych i stresowych.

Rodzina HSP90

HSP90 są wysoce konserwowanymi białkami, które stanowią 1-2% całej zawartości białek komórkowych. HSP90 składa się z trzech domen strukturalnych zidentyfikowanych na drodze trawienia proteolitycznego. Domena ~25-kDa NH2-końcowa jest połączona z wysoce konserwowanym ~55-kDa COOH-końcowym regionem przez naładowany linker, który jest zmienny w długości i składzie wśród gatunków i izoform. Opisano dwie kieszenie wiążące ATP, jedną zlokalizowaną w regionie NH2-końcowym i jedną w regionie COOH-końcowym. Po związaniu ATP lub podgrzaniu, HSP90 przechodzi z formy, w której dwie domeny NH2-końcowe są oddzielone w dimerze do takiej, w której są powiązane, tworząc toroidalną strukturę dimeru. Uważa się, że ta zmiana konformacyjna jest odpowiedzialna za wiązanie substratów. HSP90 działa jako zależny od ATP chaperon molekularny zaangażowany w składanie i aktywację nieznanej liczby białek substratowych, w tym receptorów hormonów steroidowych, kinaz białkowych i czynników transkrypcyjnych (14). Tworzenie kompleksów tych białek klienckich z HSP90 jest warunkiem koniecznym ich stabilności i funkcjonalności. Dlatego chaperony należące do rodziny HSP90 odgrywają kluczową rolę w procesach komórkowych, takich jak replikacja DNA, transkrypcja RNA, składanie białek, dojrzewanie, translokacja przez retikulum endoplazmatyczne i błony mitochondrialne, proteoliza i sygnalizacja komórkowa. HSP90 wykazuje silną specyficzność w stosunku do swoich białek klienckich. Sam HSP90 nie jest jednak w stanie promować fałdowania i/lub aktywacji żadnego ze znanych białek będących jego substratami. Do pełnej aktywności HSP90 wymagane jest współdziałanie z innymi HSP i ko-chaperonami. W przypadku receptora progesteronu zaangażowanych jest co najmniej siedem dodatkowych białek (HSP70, Hip, Hop, immunofiliny i p23). Na podstawie modelu receptora progesteronowego można stwierdzić, że substrat podlega cyklicznej przemianie pomiędzy kompleksem wczesnym (zawierającym HSP70 i Hop), kompleksem pośrednim (zawierającym HSP70, Hop i dimer HSP90) oraz kompleksem dojrzałym (zawierającym dimer HSP90 i p23) z koniecznością hydrolizy ATP. Znaczenie HSP90 dla funkcji komórkowych jest wykazane przez zastosowanie specyficznych antagonistów HSP90, takich jak geldanamycyna (GA), którzy zajmują kieszeń wiążącą ATP HSP90, uniemożliwiając w ten sposób cykl heterokompleksu HSP90. Komórki poddane działaniu GA wykazują deficyty we wzroście komórek, jak również w stabilności i aktywacji kinaz białkowych i czynników transkrypcyjnych (9). Znaczenie funkcji chaperonu HSP90 dla fizjologii komórki najlepiej ilustruje jego interakcja z czynnikami transkrypcyjnymi. Ponieważ HSP90 chaperonuje czynnik transkrypcyjny odpowiedzialny za ekspresję genów zależną od tlenu, tj. czynnik indukowany hipoksją-1α, komórki poddane działaniu GA są upośledzone w fizjologicznej odpowiedzi komórek na spadek napięcia tlenowego.

Rodzina HSP70

Białka związane z szokiem cieplnym o masie 70-kDa obejmują rodzinę wysoce konserwowanych chaperonów molekularnych, które regulują składanie białek w warunkach normalnych i stresowych (3). HSP70, podobnie jak HSP90, jest jednym z najobficiej występujących spośród tych białek, stanowiąc aż 1-2% wszystkich białek komórkowych. Białka HSP70 promują składanie powstających łańcuchów na rybosomach, translokację białek przez błony i ochronę w wysokich temperaturach poprzez interakcję z odsłoniętymi hydrofobowymi powierzchniami rozwiniętych lub częściowo sfałdowanych białek. Białka HSP70 zawierają dwie domeny, NH2-końcową domenę ATPazy i COOH-końcową domenę wiążącą peptydy. Domena wiążąca peptydy HSP70 wiąże siedmio-syndowy peptyd w konformacji wydłużonej pomiędzy subdomeną arkusza β a subdomeną α-helikalną. Uważa się, że wiązanie ATP do domeny ATPazy wyzwala uwalnianie substratu, powodując wygięcie α-domeny ku górze w elastycznym złączu w pobliżu środka długiej helisy, która rozciąga się nad peptydem. Wykazano, że ko-chaperony HSP70, takie jak Hip, Hop, HSP40 i Bag-1, odgrywają ważną rolę w modulowaniu aktywności HSP70, jak również specyficzności substratów białkowych. Hip jest 50-kDa cytozolowym białkiem, które oddziałuje z domeną ATPazy członków rodziny HSP70 i wzmacnia interakcję z substratem. Hop jest unikalnym ko-chaperonem, który ma zdolność do interakcji zarówno z maszynerią chaperonową HSP70, jak i HSP90 w różnych systemach. W nieobecności HSP40 i ATP, HSP70 preferencyjnie wiąże się z peptydami i zdenaturowanymi białkami. Jednakże w obecności HSP40, HSP70 wykazuje szerszy zakres specyficzności substratowej. Bag-1 został pierwotnie odkryty jako białko związane z Bcl-2. Oprócz interakcji z antyapoptotycznymi członkami rodziny białek Bcl-2, Bag-1 oddziałuje również specyficznie z HSP70. W warunkach stresu obserwuje się zwiększone tworzenie kompleksów Bag-1-HSP70. Wytworzenie ukierunkowanych zaburzeń genu HSP70.1 lub HSP70.3 podkreśla znaczenie HSP70 w utrzymaniu nabytej termotolerancji i zmniejszonej wrażliwości na apoptozę indukowaną ciepłem (8).

HSPs: the cellular thermometer

Indukowana ekspresja HSP jest regulowana przez czynniki transkrypcyjne szoku cieplnego (HSFs) (13). U kręgowców zidentyfikowano do tej pory cztery różne HSFs. Istnienie wielu HSFs sugeruje różnice funkcjonalne pomiędzy nimi. W przeciwieństwie do HSF1 i HSF3, HSF2 nie jest aktywowany w odpowiedzi na klasyczne bodźce stresowe. HSF1 natomiast wykazuje typowe cechy indukowalności stresu, wiązania DNA, oligomeryzacji i lokalizacji jądrowej w odpowiedzi na stresory środowiskowe, takie jak podwyższona temperatura, ekspozycja na siarczan kadmu i analogi aminokwasów. Podczas ekspresji genów, transaktywacja genów szoku cieplnego jest pośredniczona przez interakcję pomiędzy HSF1 i elementem szoku cieplnego znajdującym się w promotorze wszystkich genów HSP. W temperaturze niestresuj±cej HSF1 jest obecny w cytozolu jako nieaktywne, monomeryczne białko, które jest zwi±zane przez HSP70 i HSP90 (ryc. 2). Po szoku termicznym, HSP70 i HSP90 są rekrutowane do wiązania zdenaturowanych białek i w ten sposób są uwalniane z HSF1. Niezwiązany HSF1 lokalizuje się w jądrze, trimeryzuje i nabywa zdolności wiązania DNA. HSF1 ulega fosforylacji przy resztach serynowych, po czym następuje transaktywacja genów HSP, w tym HSP70 i HSP90. Następnie aktywność HSF1 jest negatywnie regulowana poprzez zwiększone wiązanie nowo zsyntetyzowanych HSP70 i HSP90 do HSF1. Centralnym procesem dla komórkowego wyczuwania temperatury jest zatem równowaga pomiędzy wiązaniem wolnych HSP do HSF1 lub do białek zdenaturowanych pod wpływem stresu.

Śmierć komórek: apoptoza i nekroza

Ekspozycja komórek na ciepło może skutkować apoptozą lub nekrozą w zależności od zastosowanej temperatury. Co najciekawsze, temperatura progowa indukcji apoptozy na poziomie komórkowym jest równoważna bezpiecznie tolerowanej górnej progowej systemowej temperaturze rdzenia u ludzi. Dla indukcji nekrozy konieczne jest zastosowanie w warunkach in vitro temperatur wyższych niż te, które indukują apoptozę (10). Wykazano, że ekspresja małych HSPs lub indukowalnego HSP70 zwiększa przeżywalność komórek ssaków narażonych na wiele rodzajów bodźców, takich jak ciepło lub inne formy bodźców stresu apoptotycznego (1). O ile należy przypuszczać, że funkcja antyproliferacyjna jest związana z funkcją chaperonową, zwłaszcza HSP70 i HSP27, o tyle dokładny mechanizm antyapoptotycznej funkcji obu HSP nie jest do końca jasny. Wydaje się, że istnieje wiele możliwości interakcji HSP70 ze szlakami apoptotycznymi. HSP70 podobno oddziałuje z Apaf-1, zapobiegając w ten sposób jego interakcji z prokaspazą-9 i ostatecznie apoptozie zależnej od kaspaz. Ostatnio wykazano, że HSP70 bierze również udział w apoptozie niezależnej od kaspaz poprzez specyficzną interakcję z czynnikiem indukującym apoptozę, który jest uwalniany z mitochondriów we wczesnym etapie procesu apoptotycznego.

Odpowiedź na szok zimna

Stres zimna zmienia skład lipidowy błon komórkowych i hamuje tempo syntezy białek oraz proliferację komórek. Jednak zestaw białek zwany CSP ulega ekspresji na wyższych poziomach począwszy od temperatury 32°C. Hipotermia indukuje ekspresję białek wiążących RNA, takich jak białko CIRP (cold-inducible RNA-binding protein), pierwsze CSP zidentyfikowane w komórkach ssaków, oraz białko 3 wiążące motywy RNA (4, 12). Podobnie jak HSP, CIRP również ulega ekspresji w temperaturze 37°C i jest regulowane rozwojowo, prawdopodobnie działając jako chaperon RNA. Biologia komórkowa i molekularna komórek ssaków w temperaturze 32°C jest nowym obszarem, który ma mieć znaczące implikacje dla fizjologii, na przykład w jądrach i skórze, gdzie temperatury komórek wynoszą odpowiednio 30-34°C i ~33°C.

HSP są łącznikiem pomiędzy temperaturą środowiska a funkcją komórek

HSP i CSP są ewolucyjnie najbardziej konserwowaną odpowiedzią na zmiany temperatury. Mimo że białka te zostały odkryte dawno temu, a ich funkcje molekularne są coraz lepiej poznane, związek między działaniem temperatury/HSP/CSP a funkcjami komórkowymi jest mniej zbadany. Ekspozycja komórek na podwyższoną temperaturę wpływa nie tylko na ekspresję i aktywność HSP, ale także na interakcje HSP z białkami partnerskimi. Na przykład, zwiększenie ekspresji i aktywności HSP90 przez podwyższoną temperaturę in vitro lub in vivo wpływa na stabilność i aktywność czynników transkrypcyjnych, takich jak receptor glukokortykoidowy lub czynnik indukowany hipoksją-1α. Temperatura otoczenia wpływa zatem na ekspresję genów początkowo poprzez bezpośrednią aktywację genów indukowanych ciepłem, a następnie pośrednio poprzez zmienioną ekspresję i aktywność HSP.

Dalsze perspektywy

Potrzebne są dalsze badania w celu określenia wpływu zmian temperatury w organizmie homeotermicznym na funkcje komórkowe i ekspresję genów, ponieważ w większości badań in vitro symuluje się po prostu temperaturę rdzenia ciała 37°C. Temperatura ta reprezentuje jednak tylko rdzeń naszego ciała i nie uwzględnia dynamicznych zmian temperatury w innych częściach w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Jak ważna jest precyzyjna regulacja temperatury u homeotermów najlepiej widać na przykładzie jądra. Nawet niewielkie podwyższenie temperatury moszny (która normalnie wynosi 30-34°C) wiąże się z niepłodnością. Jest to częściowo związane z wyższą ekspresją białek HSP90 i śmiercią komórkową indukowaną przez p53, jak również z obniżoną ekspresją CSP. Jest to prawdopodobnie jeden z najbardziej dramatycznych przykładów potrzeby adaptacji temperaturowej w celu „zapłodnienia” naszej planety.

.