Em Calor e Células e Proteínas

A sabedoria recebida é que formas mais elevadas de vida são governadas pela temperatura ambiente, uma vez que praticamente todos os processos bioquímicos são dependentes da temperatura. As temperaturas extremas do ar ambiente na Terra variam de -89,2°C (medida em 21 de julho de 1983, Wostock, Antártica) a +58°C (medida em 13 de setembro de 1922, Al Azizyah, Líbia). Apesar destes extremos de temperatura, as espécies homeotérmicas, como os seres humanos, têm a capacidade de regular a temperatura do seu corpo central dentro de uma faixa estreita até 37°C devido a mecanismos autônomos de regulação de temperatura. A capacidade de manter uma temperatura interna relativamente constante tem permitido que os animais homeotérmicos sejam independentes da influência das flutuações da temperatura ambiente. Além disso, adaptações notáveis ao calor e ao frio são descritas em homeotherms. Enquanto a aclimatação ao calor é conseguida em semanas, por exemplo, simplesmente aumentando a taxa de suor, a aclimatação ao frio só é conseguida após exposição a um ambiente frio durante anos. A população mais bem estudada em relação à aclimatação ao frio são os mergulhadores coreanos e japoneses tradicionais chamados Ama. Durante seu trabalho de mergulho em águas frias de 10°C, foram observadas temperaturas retais variando de 37°C a 34,8°C (7). Quando a fisiologista Suki Hong estudou estas mulheres no início dos anos 60, a sua taxa metabólica basal durante os meses de Inverno, quando mergulhavam em águas muito frias, foi significativamente elevada acima dos valores observados durante os meses mais quentes. Para compensar este déficit calórico, o consumo de alimentos aumentou em ~1.000 kcal em comparação com os não-diversos. Além disso, a taxa de calafrios na água fria foi reduzida em comparação com as mulheres que não controlavam o mergulho. No entanto, quando Hong repetiu os seus estudos nos anos 90, o Ama já não mostrava a capacidade metabólica aumentada, uma vez que (felizmente) já não mergulhavam nos seus tradicionais fatos de banho de algodão, mas dispunham de fatos húmidos para combater o stress do frio.

A temperatura corporal central dos animais de sangue frio, os chamados animais poikilotérmicos, depende da temperatura ambiente. Nos animais poikilotérmicos, a temperatura é o factor ambiental mais importante que rege a distribuição das espécies. Nos animais aquáticos poikilotérmicos, a temperatura extrema é atingida. O peixe da Antártida da subordem teleost Nototheniodei é um estenotermia extremo, que vive nas águas frias e termicamente estáveis da Antártida costeira, onde as temperaturas variam de +0,3°C a -1,86°C. Em 1998, foi descrito o verme de policarbonato Alvinella pompejana, que habita em águas profundas a temperaturas hidrotermais acima de +80°C e tem um gradiente térmico de 60°C ou mais no seu comprimento corporal.

Embora os mecanismos sistémicos de adaptação às mudanças de temperatura sejam bem conhecidos, muito menos se sabe sobre a adaptação a nível celular ou genético. A vida, como vista da perspectiva celular, mostra altas variações de temperatura mesmo nos corpos dos homeotermas (Fig. 1). Temperaturas tão altas quanto +45°C podem ser medidas na pele durante a exposição solar, o que equivale à temperatura no Saara. Os miócitos são expostos a temperaturas de até 40°C no músculo de trabalho. As temperaturas mais baixas e mais altas do núcleo do corpo, que sobreviveram em casos de hipotermia ou hipertermia acidental, são de ~30°C e ~43°C, respectivamente. Sistemicamente, as temperaturas são detectadas através de receptores de frio e calor em neurônios somatossensoriais especializados em mamíferos. Esses receptores pertencem à família de potenciais receptores transitórios de canais iônicos, que convertem estímulos de temperatura em potenciais elétricos. A nível celular, no entanto, cada célula é capaz de reagir a uma mudança de temperatura com um aumento ou diminuição da produção de proteínas. Sonna et al. (15) detectaram 227 genes upregulated e 168 downregulated (dos 12.600 investigados) usando uma abordagem chip array após exposição das células mononucleares do sangue periférico a 43°C durante 20 min. Um subconjunto dessas proteínas, as proteínas de choque térmico (HSPs), são especializadas para proteger as células contra danos induzidos pelo calor. Similar à resposta específica ao calor, cada célula é capaz de aumentar a produção de proteínas de choque frio (CSP) em resposta a uma diminuição da temperatura.

Em 1962, Ritossa descobriu as HSPs em seu trabalho pioneiro. Após um aumento da temperatura em uma incubadora contendo culturas de Drosophila, ele observou mudanças notáveis nos padrões de sopro cromossômico, ou seja, os padrões de atividade gênica dos cromossomos politens nas glândulas salivares larvares. Hoje, é bem conhecido que em resposta a muitas tensões, incluindo o calor, condições oxidantes e exposição a compostos tóxicos, todas as células produzem um conjunto comum de HSPs. O nome destas proteínas, no entanto, foi derivado do primeiro gatilho (isto é, calor) que foi identificado como aumentando a sua síntese. O aumento da expressão das HSP é mediado em múltiplos níveis: síntese de mRNA, estabilidade do mRNA e eficiência de translação. Experiências com várias espécies mostraram que o aumento da expressão destas proteínas pode proteger o organismo contra danos induzidos pelo stress. Além disso, as células que recebem uma HSP não letal – induzindo um pré-choque subseqüentemente sobrevivem a uma exposição letal a temperaturas elevadas. De forma impressionante, os padrões de expressão das HSPs mostram altos níveis de conservação entre as diferentes espécies. Assim, pensa-se que a resposta ao choque térmico seja virtualmente universal entre os organismos. No entanto, em dois casos de peixes expostos a ambientes frios e termicamente estáveis (Hydra oligatis e Trematomus bernacchii), não foi detectada resposta a choques térmicos.

Existem numerosos exemplos que mostram que a expressão das HSP pode variar com a temperatura ambiente em humanos apesar da sua capacidade de manter uma temperatura corporal central constante. O aumento da síntese de HSP tem sido observado in vivo durante o exercício no músculo cardíaco, dependendo da temperatura ambiente que afeta as adaptações miocárdicas (6). Mudanças na expressão da HSP72 nos leucócitos estão associadas com a adaptação ao exercício sob condições de alta temperatura ambiente. A importância das HSPs para a adaptação sistêmica ambiental está bem demonstrada principalmente em animais poikilotérmicos. Estes estudos também mostram que a temperatura na qual os genes de HSP são ativados é submetida à aclimatação térmica em função da estação do ano ou outras mudanças na temperatura ambiental média. Coletivamente, as HSPs evoluíram como proteínas induzíveis ao estresse geral para manter a integridade celular (11). Este mecanismo de resistência, entretanto, não ocorre apenas em situações fisiopatológicas, mas também é adaptado na fisiologia dos mamíferos, por exemplo, na resistência osmótica de queratinócitos ou células renais, onde condições osmóticas fisiológicas (via mudança na umidade ou acúmulo de cloreto de sódio/ureia, respectivamente) resultam em expressão aumentada das HSPs (2).

HSPs e chaperones moleculares

Em condições normais (sem estresse), chaperones moleculares auxiliam na rotina de dobramento e compartimentação de proteínas recém-sintetizadas, e também participam de uma variedade de outras funções celulares. Durante o stress térmico ou outras formas de stress, as HSPs induzidas pelo calor ligam-se às proteínas desnaturadas, impedindo assim a sua agregação e ajudando na sua redobramento em estados nativos e funcionais após a restauração da temperatura ambiente. As HSPs foram classificadas em células eucarióticas pelo seu peso molecular. Até à data, existem seis famílias de HSP identificadas (HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40, e as pequenas HSP). Uma vez que a expressão de alguns membros das famílias HSP é aumentada com a fome de glicose, estas proteínas são chamadas proteínas reguladas pelo glucose-regulated. Algumas HSPs, descobertas pela primeira vez independentemente do seu papel como proteínas de stress (como a ubiquitina ou αB-crystallin) carregam os seus nomes particulares. Uma visão geral das famílias de proteínas chaperone e sua estrutura e função é dada na Tabela 1. HSP90 e HSP70 em particular desempenham um papel importante na manutenção da função celular sob condições de nonstruosidade e estresse.

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HSP90 família

HSP90s são proteínas altamente conservadas, que representam 1-2% de todo o conteúdo proteico celular. A HSP90 compreende três domínios estruturais identificados pela digestão proteolítica. O domínio terminal ~25-kDa NH2 está ligado a uma região terminal altamente conservada ~55-kDa COOH por um linker carregado, que é variável em comprimento e composição entre espécies e isoformas. Foram descritas duas bolsas de ligação ATP, uma localizada na região terminal NH2 e outra na região terminal COOH. Na ligação ATP ou calor, o HSP90 muda de uma forma na qual os dois domínios terminais NH2 estão separados no dímero para um na qual estão associados, gerando uma estrutura toroidal do dímero. Esta mudança conformacional é considerada responsável pela ligação do substrato. A HSP90 atua como uma acompanhante molecular dependente de ATP envolvida na dobra e ativação de um número desconhecido de proteínas do substrato, incluindo receptores hormonais esteróides, kinases de proteína e fatores de transcrição (14). A formação complexa destas proteínas clientes com HSP90 é um pré-requisito para a sua estabilidade e funcionalidade. Portanto, os acompanhantes pertencentes à família HSP90 são atores-chave em eventos celulares, tais como replicação de DNA, transcrição de RNA, dobramento proteico, maturação, translocação através do retículo endoplasmático e membranas mitocondriais, proteólise e sinalização celular. A HSP90 apresenta uma forte especificidade para as proteínas de seus clientes. A HSP90 sozinha, entretanto, é incapaz de promover a dobra e/ou ativação de qualquer uma de suas proteínas de substrato conhecidas. Para a plena atividade, a interação da HSP90 com outras HSPs e co-chaperones é necessária. No caso do receptor de progesterona, pelo menos sete proteínas adicionais estão envolvidas (HSP70, Hip, Hop, imunofilinas, e p23). Com base no modelo do receptor de progesterona, o substrato é ciclado entre um complexo inicial (contendo HSP70 e Hop), um complexo intermediário (contendo HSP70, Hop, e um dímero HSP90), e o complexo maduro (contendo um dímero HSP90 e p23) com a necessidade de hidrólise de ATP. A importância da HSP90 para as funções celulares é demonstrada pelo uso de antagonistas específicos da HSP90 como a geldanamicina (GA) que ocupa a bolsa de ligação ATP da HSP90, impedindo assim o ciclo do heterocomplexo HSP90. As células tratadas com GA apresentam déficits no crescimento celular, bem como na estabilidade e ativação das proteínas kinases e fatores de transcrição (9). O significado da função de chaperone da HSP90 para a fisiologia celular é melhor exemplificado pela sua interação com fatores de transcrição. Desde as chaperones HSP90 o fator de transcrição responsável pela expressão gênica dependente de oxigênio, ou seja, o fator induzível pela hipóxia-1α, as células tratadas com GA são prejudicadas na resposta fisiológica das células a uma diminuição da tensão do oxigênio.

HSP70 família

As proteínas relacionadas ao choque térmico 70-kDa compreendem uma família de chaperones moleculares altamente conservadas que regulam o dobramento proteico durante condições normais e de estresse (3). A HSP70, assim como a HSP90, é uma das mais abundantes destas proteínas, representando até 1-2% da proteína celular total. As proteínas HSP70 promovem a dobra de cadeias nascentes em ribossomos, translocação de proteínas através das membranas e proteção a altas temperaturas através da interação com superfícies hidrofóbicas expostas de proteínas desdobradas ou parcialmente dobradas. As proteínas HSP70 contêm dois domínios, um domínio NH2-terminal ATPase e um domínio COOH-terminal de ligação do peptídeo. O domínio HSP70 de ligação do peptídeo liga um peptídeo de sete-resíduos em uma conformação estendida entre um subdomínio de folha β e um subdomínio de folha α-helical. Pensa-se que a ligação ATP ao domínio ATPase desencadeia a libertação do substrato ao fazer com que o subdomínio α se curve para cima numa junção flexível perto do meio da hélice longa que se estende sobre o peptídeo. As co-chaperones HSP70, tais como Hip, Hop, HSP40, e Bag-1, demonstraram desempenhar um papel importante na modulação da atividade da HSP70, bem como a especificidade do substrato proteico. A anca é uma proteína citosólica 50-kDa que foi encontrada para interagir com o domínio ATPase dos membros da família HSP70 e melhorar a interação do substrato. O lúpulo é um co-caperone único que tem a capacidade de interagir tanto com a máquina de chaperone HSP70 como com a HSP90 em vários sistemas. Na ausência da HSP40 e ATP, a HSP70 se liga preferencialmente a peptídeos e proteínas desnaturadas. No entanto, na presença da HSP40, a HSP70 exibe uma gama mais ampla de especificidade de substrato. A Bag-1 foi originalmente descoberta como uma proteína associada à Bcl-2. Além de sua interação com os membros antiapoptóticos da família da proteína Bcl-2, a Bag-1 também interage especificamente com a HSP70. Durante condições de estresse, uma maior formação de complexos Bag-1-HSP70 pode ser encontrada. A geração de disrupção genética alvo da HSP70.1 ou do gene HSP70.3 ressalta a importância da HSP70 na manutenção da termotolerância adquirida e na diminuição da sensibilidade à apoptose induzida pelo calor (8).

HSPs: o termômetro celular

A expressão induzível da HSP é regulada pelos fatores de transcrição do choque térmico (HSFs) (13). Em vertebrados, quatro diferentes HSFs foram identificados até agora. A existência de múltiplas HSFs sugere diferenças funcionais das HSFs. Em contraste com as FHS1 e as FHS3, as FHS2 não são ativadas em resposta a estímulos de estresse clássicos. HSF1, entretanto, exibe as características típicas de inducibilidade ao estresse, ligação de DNA, oligomerização e localização nuclear em resposta a fatores de estresse ambientais, como temperaturas elevadas e exposição a sulfato de cádmio e análogos de aminoácidos. Durante a expressão gênica, a transativação dos genes de choque térmico é mediada pela interação entre HSF1 e o elemento de choque térmico encontrado no promotor de todos os genes HSP. Em temperaturas não muito altas, o HSF1 está presente no citosol como uma proteína monomérica inativa que é ligada pela HSP70 e HSP90 (Fig. 2). Após o choque térmico, a HSP70 e HSP90 são recrutadas para ligar proteínas desnaturadas e, portanto, são liberadas do HSF1. O HSF1 não ligado se localiza no núcleo, trimeriza e adquire capacidade de ligação ao DNA. HSF1 torna-se fosforilado em resíduos serínicos, seguido pela transativação de genes HSP incluindo HSP70 e HSP90. Posteriormente, a atividade do HSF1 é regulada negativamente através do aumento da ligação da recém-sintetizada HSP70 e HSP90 ao HSF1. O processo central para a detecção da temperatura celular, portanto, é o equilíbrio entre a ligação de HSP livre ao HSF1 ou a proteínas desnaturadas por estresse.

Morte de células: apoptose e necrose

Exposição de células ao calor pode resultar em apoptose ou necrose, dependendo da temperatura aplicada. Mais interessante ainda, a temperatura limite de indução de apoptose a nível celular é equivalente à temperatura central sistêmica do limiar superior tolerável com segurança em humanos. Para a indução da necrose, temperaturas mais altas que as que induzem a apoptose têm de ser aplicadas in vitro (10). A expressão de pequenas HSP ou HSP70 induzível tem demonstrado aumentar a sobrevivência de células de mamíferos expostas a numerosos tipos de estímulos, como calor ou outras formas de estímulos apoptóticos de estresse (1). Enquanto deve ser assumido que a função antinecrótica está ligada à função de acompanhante, especialmente da HSP70 e HSP27, o mecanismo exato da função antiapoptótica de ambas as HSP não é totalmente claro. Parece haver múltiplas possibilidades de a HSP70 interagir com vias apoptóticas. A HSP70 interage alegadamente com o Apaf-1, impedindo assim a sua interacção com procaspase-9 e finalmente com a apoptose dependente da caspase-9. Recentemente, foi demonstrado que a HSP70 também participa de eventos apoptóticos independentes da caspas através da interação específica com o fator indutor da apoptose, que é liberada das mitocôndrias no início do processo apoptótico.

A resposta ao choque frio

A tensão fria altera a composição lipídica das membranas celulares e suprime a taxa de síntese protéica e a proliferação celular. Entretanto, um conjunto de proteínas chamado CSP é expresso em níveis mais altos a partir de uma temperatura de 32°C. A hipotermia induz a expressão de proteínas de ligação ao RNA como a proteína de ligação ao RNA induzível a frio (CIRP), a primeira CSP identificada em células de mamíferos, e a proteína de ligação ao RNA 3 (4, 12). Reminiscente da HSP, a CIRP também é expressa a 37°C e regulada para o desenvolvimento, possivelmente trabalhando como um acompanhante do RNA. A biologia celular e molecular das células de mamíferos a 32°C é uma nova área que deve ter implicações consideráveis para a fisiologia, por exemplo em testículos e pele, onde as temperaturas celulares são tipicamente 30-34°C e ~33°C, respectivamente.

HSPs são a ligação entre a temperatura ambiental e a função celular

As HSPs e CSPs são evolutivamente a resposta mais conservada às mudanças de temperatura. Embora as proteínas tenham sido descobertas há muito tempo e as funções moleculares destas proteínas sejam cada vez mais compreendidas, a ligação entre os efeitos mediados pela temperatura/HSP/CSP e as funções celulares é menos explorada. Expor as células a temperaturas elevadas afeta não apenas a expressão e atividade das HSP, mas também a interação das HSPs com as proteínas parceiras. Por exemplo, o aumento da expressão e atividade da HSP90 por temperaturas elevadas in vitro ou in vivo afeta a estabilidade e atividade de fatores de transcrição como o receptor de glicocorticóides ou o fator induzível pela hipóxia -COPY11. A temperatura ambiente afeta assim a expressão gênica inicialmente através de uma ativação direta de genes induzíveis pelo calor e posteriormente indiretamente através da expressão e atividade alterada da HSP.

Outras perspectivas

Outros estudos são necessários para determinar a influência das mudanças de temperatura no corpo homeotérmico na função celular e expressão gênica, uma vez que na maioria dos estudos in vitro simplesmente a temperatura corporal central de 37°C é simulada. Esta temperatura, no entanto, representa apenas o núcleo do nosso corpo e negligencia as mudanças dinâmicas de temperatura em outras partes sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. A importância de uma regulação precisa da temperatura em homeotherms é melhor exemplificada no testículo. Mesmo pequenas elevações da temperatura escrotal (que normalmente é de 30-34°C) estão associadas à infertilidade. Isto é parcialmente atribuído à maior expressão das proteínas HSP90 e morte celular mediada pela p53, assim como à diminuição da expressão da CSP. Este é provavelmente um dos exemplos mais dramáticos da necessidade de adaptação de temperatura para “fertilizar” nosso planeta.