Despre căldură, celule și proteine

Înțelepciunea primită este că formele superioare de viață sunt guvernate de temperatura mediului ambiant, deoarece practic toate procesele biochimice sunt dependente de temperatură. Temperaturile extreme ale aerului ambiant de pe Pământ variază de la -89,2°C (măsurată la 21 iulie 1983, Wostock, Antarctica) la +58°C (măsurată la 13 septembrie 1922, Al Azizyah, Libia). În ciuda acestor temperaturi extreme, speciile homeoterme, cum ar fi oamenii, au capacitatea de a-și regla temperatura corporală centrală într-un interval îngust până la 37°C datorită mecanismelor autonome de reglare a temperaturii. Capacitatea de a menține o temperatură internă relativ constantă a permis animalelor homeoterme să fie independente de influența fluctuațiilor de temperatură din mediul înconjurător. În plus, la homeoterme sunt descrise adaptări remarcabile la căldură și frig. În timp ce aclimatizarea la căldură se realizează în câteva săptămâni, de exemplu, prin simpla creștere a ratei de transpirație, aclimatizarea la frig se realizează numai în urma expunerii la un mediu rece timp de ani de zile. Populația cea mai bine studiată în ceea ce privește aclimatizarea la frig sunt scafandrii tradiționali coreeni și japonezi numiți Ama. În timpul activității lor de scufundare în apă de mare rece de 10°C, au fost observate temperaturi rectale cuprinse între 37°C și 34,8°C (7). Când fiziologul Suki Hong le-a studiat pe aceste femei la începutul anilor 1960, rata metabolică bazală a acestora în timpul lunilor de iarnă, când se scufundau în apă foarte rece, a fost semnificativ mai mare decât valorile observate în timpul lunilor mai calde. Pentru a compensa acest deficit caloric, consumul de alimente a crescut cu ~1.000 kcal în comparație cu persoanele care nu făceau scufundări. În plus, rata de tremurături în apa rece a fost diminuată în comparație cu femeile de control care nu fac scufundări. Cu toate acestea, atunci când Hong și-a repetat studiile în anii 1990, Ama nu au mai prezentat capacitatea metabolică sporită, deoarece (din fericire) nu se mai scufundau în costumele tradiționale de baie din bumbac, ci li s-au pus la dispoziție costume umede pentru a combate stresul provocat de frig.

Temperatura corporală centrală a animalelor cu sânge rece, așa-numitele animale poikiloterme, depinde de temperatura mediului ambiant. La animalele poikiloterme, temperatura este cel mai important factor de mediu care guvernează distribuția speciilor. Temperaturile extreme sunt atinse la animalele acvatice poikiloterme. Peștele antarctic din subordinul teleostelor Nototheniodei este un stenoterm extrem, care trăiește în apele reci, stabile din punct de vedere termic, din zona de coastă a Antarcticii, unde temperaturile variază de la +0,3°C la -1,86°C. În 1998, a fost descris viermele polichet Alvinella pompejana, care locuiește în colonii, care trăiește la temperaturi hidrotermale de adâncime de peste +80°C și are un gradient termic de 60°C sau mai mult pe lungimea corpului său.

Deși mecanismele sistemice de adaptare la schimbările de temperatură sunt bine cunoscute, se știe mult mai puțin despre adaptarea la nivel celular sau genetic. Viața, privită din perspectivă celulară, prezintă variații mari de temperatură chiar și în corpul homeotermelor (Fig. 1). Temperaturi de până la +45°C pot fi măsurate pe piele în timpul expunerii la soare, ceea ce este echivalent cu temperatura din Sahara. Miocitele sunt expuse la temperaturi de până la 40°C în mușchiul de lucru. Cea mai mică și cea mai mare temperatură centrală a corpului, care au fost supraviețuite în cazuri de hipotermie sau hipertermie accidentală, sunt de ~30°C și, respectiv, ~43°C. La nivel sistemic, temperaturile sunt percepute prin intermediul receptorilor de frig și căldură de pe neuronii somatosenzoriali specializați ai mamiferelor. Acești receptori aparțin familiei de canale ionice cu potențial receptor tranzitoriu, care transformă stimulii de temperatură în potențiale electrice. La nivel celular, însă, fiecare celulă este capabilă să reacționeze la o schimbare de temperatură prin creșterea sau scăderea producției de proteine. Sonna et al. (15) au detectat 227 de gene suprareglementate și 168 de gene subreglementate (din 12 600 investigate) prin utilizarea unei abordări de tip chip array după expunerea celulelor mononucleare din sângele periferic la 43°C timp de 20 de minute. Un subset al acestor proteine, proteinele de șoc termic (HSP), sunt specializate în protejarea celulelor împotriva leziunilor induse de căldură. Similar răspunsului specific la căldură, fiecare celulă este capabilă de o producție sporită de proteine de șoc la rece (CSP) ca răspuns la o scădere a temperaturii.

În 1962, Ritossa a descoperit HSP-urile în lucrarea sa de pionierat. După o creștere a temperaturii într-un incubator care conținea culturi de Drosophila, el a observat schimbări remarcabile în modelele de pufărire cromozomială, adică în modelele de activitate genetică ale cromozomilor politeeni din glandele salivare ale larvelor. În prezent, este bine cunoscut faptul că, ca răspuns la numeroase stresuri, inclusiv la căldură, condiții de oxidare și expunerea la compuși toxici, toate celulele produc un set comun de HSP-uri. Cu toate acestea, numele acestor proteine a fost derivat de la primul factor declanșator (de exemplu, căldura) care a fost identificat ca fiind cel care crește sinteza lor. Expresia crescută a HSP este mediată la mai multe niveluri: sinteza ARNm, stabilitatea ARNm și eficiența traducerii. Experimentele cu diferite specii au arătat că o expresie crescută a acestor proteine poate proteja organismul împotriva daunelor induse de stres. Mai mult decât atât, celulele cărora li s-a administrat un preshock nonletal care induce HSP supraviețuiesc ulterior unei expuneri altfel letale la temperaturi ridicate. În mod surprinzător, modelele de expresie ale HSP-urilor prezintă niveluri ridicate de conservare între diferitele specii. Astfel, se consideră că răspunsul la șocul termic este practic universal în rândul organismelor. Cu toate acestea, în două cazuri de pești expuși la medii reci, stabile din punct de vedere termic (Hydra oligatis și Trematomus bernacchii), nu a fost detectat niciun răspuns la șocul termic.

Există numeroase exemple care arată că expresia HSP poate varia în funcție de temperatura mediului la om, în ciuda capacității acestuia de a menține o temperatură corporală centrală constantă. Sinteza crescută a HSP a fost observată in vivo în timpul exercițiilor fizice în mușchiul cardiac, în funcție de temperatura ambientală care afectează adaptările miocardice (6). Modificările în expresia HSP72 în leucocite sunt asociate cu adaptarea la exerciții fizice în condiții de temperatură ambientală ridicată. Importanța HSP-urilor pentru adaptarea sistemică la mediu este bine demonstrată mai ales la animalele poikilotermice. Aceste studii arată, de asemenea, că temperatura la care sunt activate genele HSP este supusă aclimatizării termice în funcție de anotimp sau de alte modificări ale temperaturii medii de mediu. În mod colectiv, HSP-urile au evoluat ca proteine generale inductibile de stres pentru a menține integritatea celulară (11). Cu toate acestea, acest mecanism de rezistență nu are loc numai în situații fiziopatologice, ci este adaptat și în fiziologia mamiferelor, de exemplu, în rezistența osmotică a keratinocitelor sau a celulelor renale, unde condițiile osmotice fiziologice (prin schimbarea umidității sau, respectiv, acumularea de clorură de sodiu/uree) determină o expresie sporită a HSP-urilor (2).

HSPs și chaperonii moleculari

În condiții normale (fără stres), chaperonii moleculari ajută la plierea și compartimentarea de rutină a proteinelor nou sintetizate și participă, de asemenea, la o varietate de alte funcții celulare. În timpul stresului termic sau al altor forme de stres, HSP-urile induse de căldură se leagă de proteinele denaturate, împiedicând astfel agregarea lor și ajutând la replierea lor în stări native, funcționale, după restabilirea temperaturii ambiante. HSP-urile au fost clasificate în celulele eucariote în funcție de greutatea lor moleculară. Până în prezent, au fost identificate șase familii de HSP (HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40 și HSP-urile mici). Deoarece expresia unor membri ai familiilor HSP este crescută în cazul lipsei de glucoză, aceste proteine sunt numite proteine reglementate de glucoză. Unele HSP-uri, descoperite pentru prima dată independent de rolul lor de proteine de stres (cum ar fi ubiquitina sau αB-cristalina) poartă numele lor particular. O prezentare generală a familiilor de proteine chaperone și a structurii și funcției acestora este prezentată în tabelul 1. HSP90 și HSP70, în special, joacă un rol important în menținerea funcției celulare în condiții de non-stres și de stres.

Familia HSP90

HSP90 sunt proteine foarte conservate, care reprezintă 1-2% din întregul conținut proteic celular. HSP90 cuprinde trei domenii structurale identificate prin digestie proteolitică. Domeniul NH2-terminal de ~25-kDa este conectat la o regiune extrem de conservată de ~55-kDa COOH-terminală prin intermediul unui linker încărcat, care este variabil în lungime și compoziție între specii și izoforme. Au fost descrise două buzunare de legare a ATP, unul situat în regiunea NH2-terminală și unul în regiunea COOH-terminală. La legarea ATP sau la căldură, HSP90 trece de la o formă în care cele două domenii NH2-terminale sunt separate în dimer la una în care acestea sunt asociate, generând o structură de dimer toroidal. Se crede că această schimbare de conformație este responsabilă pentru legarea substratului. HSP90 acționează ca o chaperonă moleculară dependentă de ATP, implicată în plierea și activarea unui număr necunoscut de proteine-substrat, inclusiv a receptorilor de hormoni steroizi, a protein-kinazelor și a factorilor de transcripție (14). Formarea complexului dintre aceste proteine client și HSP90 este o condiție prealabilă pentru stabilitatea și funcționalitatea lor. Prin urmare, chaperonii aparținând familiei HSP90 sunt actori-cheie în evenimente celulare, cum ar fi replicarea ADN-ului, transcripția ARN-ului, plierea proteinelor, maturarea, translocarea prin reticulul endoplasmatic și membranele mitocondriale, proteoliza și semnalizarea celulară. HSP90 prezintă o puternică specificitate pentru proteinele sale client. Cu toate acestea, HSP90 singură este incapabilă să promoveze plierea și/sau activarea oricăreia dintre proteinele sale substrat cunoscute. Pentru o activitate completă, este necesară interacțiunea HSP90 cu alte HSP-uri și cochaperone. În cazul receptorului de progesteron, sunt implicate cel puțin șapte proteine suplimentare (HSP70, Hip, Hop, imunofiline și p23). Pe baza modelului receptorului de progesteron, substratul se ciclează între un complex timpuriu (care conține HSP70 și Hop), un complex intermediar (care conține HSP70, Hop și un dimer HSP90) și complexul matur (care conține un dimer HSP90 și p23) cu necesitatea hidrolizei ATP. Importanța HSP90 pentru funcțiile celulare este demonstrată prin utilizarea unor antagoniști specifici ai HSP90, cum ar fi geldanamicina (GA), care ocupă buzunarul de legare a ATP al HSP90, împiedicând astfel ciclul heterocomplexului HSP90. Celulele tratate cu GA prezintă deficiențe în ceea ce privește creșterea celulară, precum și stabilitatea și activarea protein-kinazelor și a factorilor de transcripție (9). Semnificația funcției de chaperon HSP90 pentru fiziologia celulară este cel mai bine exemplificată de interacțiunea sa cu factorii de transcripție. Deoarece HSP90 chaperonează factorul de transcripție responsabil pentru expresia genelor dependente de oxigen, adică factorul inductibil de hipoxie-1α, celulele tratate cu GA sunt afectate în răspunsul fiziologic al celulelor la o scădere a tensiunii de oxigen.

Familia HSP70

Proteinele de 70 kDa legate de șocurile termice cuprind o familie de chaperoni moleculari foarte conservate care reglează plierea proteinelor în condiții normale și de stres (3). HSP70, ca și HSP90, este una dintre cele mai abundente dintre aceste proteine, reprezentând până la 1-2% din totalul proteinelor celulare. Proteinele HSP70 promovează plierea lanțurilor născute pe ribozomi, translocarea proteinelor prin membrane și protecția la temperaturi ridicate prin interacțiunea cu suprafețele hidrofobe expuse ale proteinelor desfășurate sau parțial pliate. Proteinele HSP70 conțin două domenii, un domeniu ATPază NH2-terminal și un domeniu de legare a peptidelor COOH-terminal. Domeniul de legare a peptidelor HSP70 se leagă de o peptidă cu șapte resturi într-o conformație extinsă între un subdomeniu β-sheet și un subdomeniu α-helical. Se crede că legarea ATP la domeniul ATPază declanșează eliberarea substratului prin faptul că determină îndoirea în sus a domeniului α la o joncțiune flexibilă în apropierea mijlocului helixului lung care se extinde peste peptidă. S-a demonstrat că cochaperonii HSP70, cum ar fi Hip, Hop, HSP40 și Bag-1, joacă un rol important în modularea activității HSP70, precum și a specificității substratului proteic. Hip este o proteină citosolică de 50 kDa care se pare că interacționează cu domeniul ATPază al membrilor familiei HSP70 și îmbunătățește interacțiunea cu substratul. Hop este o co-chaperonă unică care are capacitatea de a interacționa atât cu mașinăria de chaperonare HSP70, cât și cu cea HSP90 în diferite sisteme. În absența HSP40 și a ATP, HSP70 se leagă preferențial de peptide și proteine denaturate. Cu toate acestea, în prezența HSP40, HSP70 prezintă o gamă mai largă de specificitate a substratului. Bag-1 a fost descoperit inițial ca o proteină asociată cu Bcl-2. Pe lângă interacțiunea sa cu membrii antiapoptotici ai familiei de proteine Bcl-2, Bag-1 interacționează, de asemenea, în mod specific cu HSP70. În condiții de stres, se poate observa o formare crescută a complexelor Bag-1-HSP70. Generarea de întreruperi genetice țintite ale genei HSP70.1 sau HSP70.3 subliniază importanța HSP70 în menținerea termotoleranței dobândite și a sensibilității scăzute la apoptoza indusă de căldură (8).

HSPs: termometrul celular

Expresia HSP inductibilă este reglată de factorii de transcripție a șocului termic (HSFs) (13). La vertebrate, au fost identificați până în prezent patru HSF diferiți. Existența mai multor HSF-uri sugerează diferențe funcționale ale HSF-urilor. Spre deosebire de HSF1 și HSF3, HSF2 nu este activat ca răspuns la stimulii clasici de stres. Cu toate acestea, HSF1 prezintă caracteristicile tipice de inducere a stresului, legare la ADN, oligomerizare și localizare nucleară ca răspuns la factorii de stres din mediul înconjurător, cum ar fi temperaturile ridicate și expunerea la sulfat de cadmiu și la analogi de aminoacizi. În timpul exprimării genelor, transactivarea genelor de șoc termic este mediată de interacțiunea dintre HSF1 și elementul de șoc termic care se găsește în promotorul tuturor genelor HSP. La temperaturi fără stres, HSF1 este prezentă în citosol ca o proteină monomerică inactivă, care este legată de HSP70 și HSP90 (figura 2). În urma șocului termic, HSP70 și HSP90 sunt recrutate pentru a lega proteinele denaturate și, prin urmare, sunt eliberate din HSF1. HSF1 nelegat se localizează în nucleu, se trimerizează și dobândește capacitatea de legare a ADN-ului. HSF1 devine fosforilat la nivelul reziduurilor de serină, urmat de transactivarea genelor HSP, inclusiv HSP70 și HSP90. Ulterior, activitatea HSF1 este reglată negativ prin creșterea legăturii HSP70 și HSP90 nou sintetizate cu HSF1. Prin urmare, procesul central pentru detectarea temperaturii celulare este echilibrul dintre legarea HSP-urilor libere la HSF1 sau la proteinele denaturate de stres.

Moartea celulară: apoptoză și necroză

Expunerea celulelor la căldură poate duce la apoptoză sau necroză în funcție de temperatura aplicată. Cel mai interesant este faptul că temperatura prag de inducere a apoptozei la nivel celular este echivalentă cu pragul superior tolerabil în condiții de siguranță al temperaturii centrale sistemice la om. Pentru inducerea necrozei, trebuie să se aplice in vitro temperaturi mai ridicate decât cele care induc apoptoza (10). S-a demonstrat că expresia HSP-urilor mici sau a HSP70 inductibile sporește supraviețuirea celulelor de mamifere expuse la numeroase tipuri de stimuli, cum ar fi căldura sau alte forme de stimuli de stres apoptotic (1). Deși trebuie să se presupună că funcția antinecrotică este legată de funcția de chaperon, în special a HSP70 și HSP27, mecanismul exact al funcției antiapoptotice a celor două HSP nu este pe deplin clar. Se pare că există mai multe posibilități ca HSP70 să interacționeze cu căile apoptotice. Se pare că HSP70 interacționează cu Apaf-1, împiedicând astfel interacțiunea acesteia cu procaspaza-9 și, în final, apoptoza dependentă de caspază. Recent, s-a demonstrat că HSP70 participă, de asemenea, la evenimentele apoptotice independente de caspază prin interacțiunea specifică cu factorul care induce apoptoza, care este eliberat din mitocondrii la începutul procesului apoptotic.

Răspunsul la șocul rece

Solicitarea la rece modifică compoziția lipidică a membranelor celulare și suprimă rata de sinteză a proteinelor și proliferarea celulară. Cu toate acestea, un set de proteine numite CSP este exprimat la niveluri mai ridicate începând cu o temperatură de 32°C. Hipotermia induce exprimarea proteinelor de legare a ARN-ului, cum ar fi proteina de legare a ARN-ului indus de frig (CIRP), prima CSP identificată în celulele mamiferelor, și proteina cu motiv de legare a ARN-ului 3 (4, 12). Amintind de HSP, CIRP este, de asemenea, exprimată la 37°C și este reglată din punct de vedere al dezvoltării, funcționând probabil ca un chaperon ARN. Biologia celulară și moleculară a celulelor de mamifere la 32°C este un domeniu nou care se așteaptă să aibă implicații considerabile pentru fiziologie, de exemplu în testicule și piele, unde temperaturile celulare sunt de obicei de 30-34°C și, respectiv, ~33°C.

HSP-urile sunt legătura dintre temperatura mediului și funcția celulară

HSP-urile și CSP-urile sunt, din punct de vedere evolutiv, cel mai conservat răspuns la schimbările de temperatură. Deși proteinele au fost descoperite cu mult timp în urmă și funcțiile moleculare ale acestor proteine sunt din ce în ce mai bine înțelese, legătura dintre efectele mediate de temperatură/HSP/CSP și funcțiile celulare este mai puțin explorată. Expunerea celulelor la temperaturi ridicate afectează nu numai expresia și activitatea HSP, ci și interacțiunea HSP-urilor cu proteinele partenere. De exemplu, creșterea expresiei și activității HSP90 prin temperaturi ridicate in vitro sau in vivo afectează stabilitatea și activitatea factorilor de transcripție, cum ar fi receptorul glucocorticoid sau factorul inductibil în hipoxie-1α. Temperatura ambientală afectează astfel expresia genică inițial printr-o activare directă a genelor inductibile de căldură și, ulterior, indirect, prin modificarea expresiei și activității HSP.

Perspective viitoare

Sunt necesare studii suplimentare pentru a determina influența modificărilor de temperatură în corpul homeotermic asupra funcției celulare și expresiei genice, deoarece în majoritatea studiilor in vitro este simulată pur și simplu temperatura corpului central de 37°C. Cu toate acestea, această temperatură reprezintă doar nucleul corpului nostru și neglijează modificările dinamice ale temperaturii în alte părți în condiții fiziologice și fiziopatologice. Importanța reglării precise a temperaturii la homeoterme este cel mai bine exemplificată în cazul testiculelor. Chiar și ușoare creșteri ale temperaturii scrotului (care este în mod normal de 30-34°C) sunt asociate cu infertilitatea. Acest lucru este atribuit parțial expresiei mai mari a proteinelor HSP90 și morții celulare mediate de p53, precum și scăderii expresiei CSP. Acesta este probabil unul dintre cele mai dramatice exemple ale nevoii de adaptare la temperatură pentru a „fertiliza” planeta noastră.

.