Stala se regentkou Skotska
Po Jakubově smrti se Marie z Guise domnívala, že se stane regentkou, ale tato role byla svěřena Jakubu Hamiltonovi, hraběti z Arranu. Arran byl stoupencem protestantské Anglie. Uzavřel dohodu, aby se mladá Marie provdala za anglického prince Eduarda, až dosáhne věku 10 let, což Marie z Guise odmítla. Anglický král Jindřich VIII. zahájil sérii divokých útoků na Skotsko, často označovaných jako drsné námluvy, jejichž cílem bylo přinutit Skoty, aby sňatek povolili. V reakci na to Marie z Guise v roce 1548 zařídila, aby mladá královna Marie odcestovala do Francie a byla připravována na sňatek s dauphinem Francoisem, což dále posílilo vazby s Francií. Francouzi na oplátku poskytli Skotům vojenskou podporu.
Teprve 12. dubna 1554, po několika letech nepokojů s Anglií, se Marii z Guise konečně podařilo vyrvat lordu Arranovi vládu a jmenovat ji skotskou královnou regentkou. Během svého působení ve funkci skotské regentky čelila Marie z Guise neustálým konfliktům. Jejím cílem bylo modernizovat Skotsko a zároveň ho udržet katolické a bez anglických zásahů, ale proti jejímu úsilí se postavilo mnoho skotských stoupenců Anglie a protestantského hnutí.
Protestantská reforma byla v té době silná. Jedním z takových reformátorů byl John Knox, který kázal proti Mariině regentství a chtěl ji svrhnout, aby ve Skotsku založil protestantskou církev. Pod vedením skupiny šlechticů nazývané páni z kongregace se proangličtí stoupenci nadále bouřili proti Marii z Guise. Byli podezřívaví vůči jejím přetrvávajícím vazbám na katolickou Francii, které posílil sňatek její dcery s Francoisem v roce 1558.
Protestanti nadále posilovali a vedli povstání proti Marii z Guise. Marie se 22. května 1559 utkala s protestantskými pány z kongregace v Perthu, ale musela ustoupit do Edinburghu, kde s pomocí francouzských vojsk město znovu dobyla poté, co Knox a protestantští reformátoři vyzvali k jejímu sesazení.
Aby toho nebylo málo, Anglie, které nyní vládla královna Alžběta I., nadále posílala posily, aby ze Skotska odstranila francouzské vojáky, a sporadické boje pokračovaly.