Kommet som regent af Skotland
Efter James’ død troede Mary of Guise, at hun ville blive regent, men rollen blev overdraget til James Hamilton, jarl af Arran. Arran var en tilhænger af det protestantiske England. Han lavede en aftale om, at den unge Mary skulle gifte sig med Englands prins Edward, når hun fyldte 10 år, hvilket Mary of Guise afviste. Henrik 8. af England indledte en række brutale angreb på Skotland, ofte omtalt som den hårde bejlen, der havde til formål at tvinge skotterne til at tillade ægteskabet. Som svar herpå sørgede Mary of Guise i 1548 for, at den unge dronning Mary rejste til Frankrig og blev forberedt til at gifte sig med Dauphin Francois, hvilket styrkede båndene med Frankrig yderligere. Franskmændene ydede til gengæld militær støtte til skotterne.
Det var først den 12. april 1554, efter flere års uroligheder med England, at Mary of Guise endelig var i stand til at vriste kontrollen fra Lord Arran og blive udnævnt til dronning regent af Skotland. I sin tid som regent af Skotland stod Mary of Guise over for konstante konflikter. Hendes mål var at modernisere Skotland og samtidig holde det katolsk og fri for engelsk indblanding, men der var mange skotske tilhængere af England og den protestantiske bevægelse, som modarbejdede hendes bestræbelser.
Den protestantiske reform var stærk på det tidspunkt. En af disse reformatorer var John Knox, som prædikede mod Marias regentskab og ønskede at vælte hende for at etablere den protestantiske kirke i Skotland. Anført af en gruppe adelsmænd, kaldet Lords of the Congregation, fortsatte de pro-engelske tilhængere med at gøre oprør mod Mary of Guise. De var mistænksomme over for hendes fortsatte bånd til det katolske Frankrig, som blev styrket af hendes datters ægteskab med Francois i 1558.
Protestanterne fortsatte med at vinde styrke og ledte oprør mod Mary of Guise. Mary stod over for de protestantiske kongregationsherrer i Perth den 22. maj 1559, men måtte trække sig tilbage til Edinburgh, hvor hun med hjælp fra franske tropper generobrede byen, efter at Knox og de protestantiske reformatorer havde krævet, at hun skulle afsættes.
For at gøre tingene endnu værre fortsatte England, der nu blev regeret af dronning Elizabeth I, med at sende forstærkninger for at fjerne franske soldater fra Skotland, og sporadiske kampe fortsatte.