Om varme, celler og proteiner

Det er en udbredt opfattelse, at højere former for liv er styret af den omgivende temperatur, da stort set alle biokemiske processer er temperaturafhængige. De ekstreme lufttemperaturer på Jorden varierer fra -89,2 °C (målt den 21. juli 1983 i Wostock, Antarktis) til +58 °C (målt den 13. september 1922 i Al Azizyah, Libyen). På trods af disse ekstreme temperaturer har homøoterme arter, som f.eks. mennesker, evnen til at regulere deres kropstemperatur inden for et snævert interval på 37 °C på grund af autonome temperaturreguleringsmekanismer. Evnen til at opretholde en relativt konstant indre temperatur har gjort det muligt for homeoterme dyr at være uafhængige af indflydelsen fra udsving i omgivelsestemperaturen. Desuden er der beskrevet bemærkelsesværdige tilpasninger til varme og kulde hos homeotherme dyr. Mens varmeakklimatisering opnås i løbet af få uger, f.eks. ved simpelthen at øge svedraten, opnås akklimatisering til kulde først, når man har været udsat for et koldt miljø i årevis. Den bedst undersøgte population med hensyn til kuldeakklimatisering er de traditionelle koreanske og japanske dykkere kaldet Ama. Under deres dykning i 10°C koldt havvand er der observeret rektaltemperaturer på mellem 37°C og 34,8°C (7). Da fysiologen Suki Hong undersøgte disse kvinder i begyndelsen af 1960’erne, var deres basale stofskifte i vintermånederne, hvor de dykkede i meget koldt vand, betydeligt højere end de værdier, der blev observeret i de varmere måneder. For at kompensere for dette kalorieunderskud steg fødeindtaget med ~1.000 kcal sammenlignet med ikke-dykkere. Desuden blev rystelsesfrekvensen i koldt vand nedsat sammenlignet med kontrolkvinder, der ikke dykkede. Da Hong gentog sine undersøgelser i 1990’erne, viste Ama imidlertid ikke længere den forbedrede metaboliske kapacitet, da de (heldigvis) ikke længere dykkede i deres traditionelle bomuldsbadedragter, men fik våddragter til at bekæmpe kuldebelastningen.

Den centrale kropstemperatur hos koldblodede dyr, de såkaldte poikiloterme dyr, afhænger af den omgivende temperatur. Hos poikiloterme dyr er temperaturen den vigtigste miljøfaktor, der styrer arternes fordeling. Ekstreme temperaturer opnås hos poikiloterme vandlevende dyr. Den antarktiske fisk i teleost-underordenen Nototheniodei er en ekstrem stenoterm, som lever i de kolde, termisk stabile farvande ved Antarktis’ kyster, hvor temperaturen varierer fra +0,3 °C til -1,86 °C. I 1998 blev den kolonilevende polychaetorm Alvinella pompejana, der lever i dybhavshydrotermiske temperaturer på over +80°C og har en termisk gradient på 60°C eller mere over sin kropslængde, beskrevet.

Selv om de systemiske mekanismer for tilpasning til temperaturændringer er velkendte, er der langt mindre viden om tilpasningen på celle- eller genetisk niveau. Livet, set fra et celleperspektiv, viser store temperaturvariationer selv i kroppen af homeotherme dyr (fig. 1). Der kan måles temperaturer så høje som +45 °C på huden under soleksponering, hvilket svarer til temperaturen i Sahara. Myocytter udsættes for temperaturer på op til 40 °C i den arbejdende muskel. Den laveste og højeste kernetemperatur i kroppen, som blev overlevet i tilfælde af utilsigtet hypotermi eller hypertermi, er henholdsvis ~30 °C og ~43 °C. Systemisk registreres temperaturerne via kulde- og varmereceptorer på specialiserede somatosensoriske neuroner hos pattedyr. Disse receptorer tilhører familien af ionkanaler af transient receptor potential-familien, som omdanner temperaturstimuli til elektriske potentialer. På celleniveau er hver enkelt celle imidlertid i stand til at reagere på en temperaturændring med en øget eller nedsat produktion af proteiner. Sonna et al. (15) påviste 227 opregulerede og 168 nedregulerede gener (ud af 12 600 undersøgte) ved hjælp af en chip array-metode efter eksponering af mononukleære celler fra perifert blod til 43 °C i 20 minutter. En delmængde af disse proteiner, nemlig varmechokproteinerne (HSP’er), er specialiseret i at beskytte celler mod varmeinducerede skader. I lighed med det specifikke varmerespons er hver celle i stand til at øge produktionen af kuldechokproteiner (CSP) som reaktion på et temperaturfald.

I 1962 opdagede Ritossa HSP’erne i sit pionerarbejde. Efter en forøgelse af temperaturen i en inkubator med Drosophila-kulturer observerede han bemærkelsesværdige ændringer i de kromosomale puffemønstre, dvs. genaktivitetsmønstrene i de polytene kromosomer i larvernes spytkirtler. I dag er det velkendt, at alle celler som reaktion på mange belastninger, herunder varme, oxiderende forhold og udsættelse for giftige stoffer, producerer et fælles sæt HSP’er. Navnet på disse proteiner stammer imidlertid fra den første udløsende faktor (dvs. varme), der blev identificeret som værende med til at øge deres syntese. Øget ekspression af HSP’er formidles på flere niveauer: mRNA-syntese, mRNA-stabilitet og translationseffektivitet. Eksperimenter med forskellige arter har vist, at øget ekspression af disse proteiner kan beskytte organismen mod stressinducerede skader. Desuden overlever celler, der har fået et ikke-dødeligt HSP-inducerende preshock, efterfølgende en ellers dødelig eksponering for forhøjede temperaturer. Det er påfaldende, at ekspressionsmønstrene for HSP’er viser en høj grad af bevarelse blandt de forskellige arter. Varmestødresponsen menes således at være praktisk talt universel blandt organismer. I to tilfælde af fisk, der er udsat for kolde, termisk stabile miljøer (Hydra oligatis og Trematomus bernacchii), er der imidlertid ikke påvist noget hedeshockrespons.

Der er talrige eksempler, der viser, at HSP-ekspressionen kan variere med omgivelsestemperaturen hos mennesker på trods af deres evne til at opretholde en konstant kernetemperatur i kroppen. Der er observeret øget HSP-syntese in vivo under træning i hjertemusklen afhængigt af den omgivende temperatur, der påvirker myokardiets tilpasninger (6). Ændringer i HSP72-ekspressionen i leukocytter er forbundet med tilpasning til træning under høje omgivelsestemperaturer. HSP’ernes betydning for systemisk miljøtilpasning er veldokumenteret, især hos poikiloterme dyr. Disse undersøgelser viser også, at den temperatur, ved hvilken HSP-generne aktiveres, er underlagt termisk akklimatisering som en funktion af årstiden eller andre ændringer i den gennemsnitlige miljøtemperatur. Samlet set har HSP’erne udviklet sig som generelle stress-inducerbare proteiner til at opretholde den cellulære integritet (11). Denne modstandsmekanisme finder imidlertid ikke kun sted i patofysiologiske situationer, men er også tilpasset i pattedyrs fysiologi, f.eks. i keratinocytternes eller nyrecellernes osmotiske modstandsdygtighed, hvor fysiologiske osmotiske forhold (via henholdsvis ændring i luftfugtighed eller natriumklorid/urea-akkumulering) resulterer i øget ekspression af HSP’er (2).

HSP’er og molekylære chaperoner

Under normale (ikke-stressende) forhold hjælper molekylære chaperoner med den rutinemæssige foldning og kompartmentalisering af nyligt syntetiserede proteiner, og de deltager også i en række andre cellulære funktioner. Under termisk eller anden form for stress binder varmeinducerede HSP’er sig til denaturerede proteiner og forhindrer derved deres aggregering og hjælper dem med at omfolde sig til native, funktionelle tilstande efter genoprettelse af omgivelsestemperaturen. HSP’er er blevet klassificeret i eukaryote celler efter deres molekylvægt. Indtil nu er der identificeret seks HSP-familier (HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40 og de små HSP’er). Da ekspressionen af nogle medlemmer af HSP-familierne øges ved glukosesult, kaldes disse proteiner for glukoseregulerede proteiner. Nogle HSP’er, der først blev opdaget uafhængigt af deres rolle som stressproteiner (som ubiquitin eller αB-krystallin), bærer deres særlige navne. En oversigt over chaperonproteinfamilierne og deres struktur og funktion findes i tabel 1. Især HSP90 og HSP70 spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af den cellulære funktion under ikke-stress- og stressbetingelser.

HSP90-familie

HSP90’er er stærkt konserverede proteiner, som udgør 1-2 % af hele det cellulære proteinindhold. HSP90 består af tre strukturelle domæner, der er identificeret ved proteolytisk fordøjelse. Det ~25 kDa NH2-terminale domæne er forbundet med en meget konserveret ~55 kDa COOH-terminal region af en ladet linker, som er variabel i længde og sammensætning blandt arter og isoformer. Der er beskrevet to ATP-bindingslommer, en placeret i den NH2-terminale og en i den COOH-terminale region. Ved ATP-binding eller varme skifter HSP90 fra en form, hvor de to NH2-terminale domæner er adskilt i dimeren, til en form, hvor de er associeret, hvilket genererer en toroidal dimerstruktur. Denne konformationsændring menes at være ansvarlig for substratbinding. HSP90 fungerer som en ATP-afhængig molekylær chaperon, der er involveret i foldning og aktivering af et ukendt antal substratproteiner, herunder steroidhormonreceptorer, proteinkinaser og transkriptionsfaktorer (14). Kompleksdannelsen af disse klientproteiner med HSP90 er en forudsætning for deres stabilitet og funktionalitet. Derfor er chaperoner, der tilhører HSP90-familien, nøgleaktører i cellulære begivenheder som f.eks. DNA-replikation, RNA-transkription, proteinfoldning, modning, translokation gennem det endoplasmatiske retikulum og mitokondriemembraner, proteolyse og cellesignalering. HSP90 udviser en stærk specificitet for sine klientproteiner. HSP90 alene er imidlertid ikke i stand til at fremme foldningen og/eller aktiveringen af nogen af sine kendte substratproteiner. For at opnå fuld aktivitet er det nødvendigt med et samspil mellem HSP90 og andre HSP’er og co-chaperoner for at opnå fuld aktivitet. I tilfældet med progesteronreceptoren er mindst syv yderligere proteiner involveret (HSP70, Hip, Hop, immunofiliner og p23). På grundlag af progesteronreceptormodellen cykler substratet mellem et tidligt kompleks (indeholdende HSP70 og Hop), et intermediært kompleks (indeholdende HSP70, Hop og en HSP90-dimer) og det modne kompleks (indeholdende en HSP90-dimer og p23) med nødvendigheden af ATP-hydrolyse. HSP90’s betydning for de cellulære funktioner påvises ved hjælp af specifikke HSP90-antagonister som geldanamycin (GA), der besætter HSP90’s ATP-bindingslomme og dermed forhindrer cyklingen af HSP90-heterokomplekset. GA-behandlede celler udviser underskud i cellevækst samt i stabilitet og aktivering af proteinkinaser og transkriptionsfaktorer (9). Betydningen af HSP90-chaperonfunktionen for cellens fysiologi illustreres bedst ved dens interaktion med transkriptionsfaktorer. Da HSP90 chaperoner den transkriptionsfaktor, der er ansvarlig for ilt-afhængig genekspression, dvs. den hypoxi-inducerbare faktor-1α, er GA-behandlede celler svækket i cellernes fysiologiske respons på et fald i iltspændingen.

HSP70-familien

De 70-kDa varmechokrelaterede proteiner omfatter en familie af stærkt konserverede molekylære chaperoner, der regulerer proteinfoldningen under normale og stressbetingelser (3). HSP70 er ligesom HSP90 et af de hyppigst forekommende af disse proteiner og udgør op til 1-2 % af det samlede cellulære protein. HSP70-proteiner fremmer foldningen af spirende kæder på ribosomer, translokation af proteiner på tværs af membraner og beskyttelse ved høje temperaturer via interaktion med eksponerede hydrofobiske overflader af udfoldede eller delvist foldede proteiner. HSP70-proteiner indeholder to domæner, et NH2-terminalt ATPase-domæne og et COOH-terminalt peptidbindingsdomæne. HSP70-peptidbindingsdomænet binder et peptid med syv resider i en udvidet konformation mellem et β-ark-subdomæne og et α-helikalt subdomæne. Det antages, at ATP-binding til ATPase-domænet udløser substratfrigivelse ved at få α-domænet til at bøje opad ved et fleksibelt knudepunkt nær midten af den lange helix, der strækker sig over peptidet. HSP70 co-chaperoner, såsom Hip, Hop, HSP40 og Bag-1, har vist sig at spille en vigtig rolle i modulering af HSP70-aktiviteten såvel som proteinsubstratspecificiteten. Hip er et cytosolisk 50 kDa-protein, der har vist sig at interagere med ATPase-domænet hos HSP70-familiemedlemmer og forbedre substratinteraktionen. Hop er et unikt co-chaperon, der har evnen til at interagere med både HSP70- og HSP90-chaperonmaskineriet i forskellige systemer. I fravær af HSP40 og ATP binder HSP70 fortrinsvis til peptider og denatureret protein. I tilstedeværelse af HSP40 udviser HSP70 imidlertid en bredere vifte af substratspecificitet. Bag-1 blev oprindeligt opdaget som et Bcl-2-associeret protein. Ud over dets interaktion med antiapoptotiske medlemmer af Bcl-2-proteinfamilien interagerer Bag-1 også specifikt med HSP70. Under stressbetingelser kan der konstateres en øget dannelse af Bag-1-HSP70-komplekser. Generering af målrettet genafbrydelse af HSP70.1- eller HSP70.3-genet understreger betydningen af HSP70 for opretholdelse af erhvervet termotolerance og nedsat følsomhed over for varmeinduceret apoptose (8).

HSP’er: det cellulære termometer

Den inducerbare HSP-ekspression reguleres af varmechoktransskriptionsfaktorerne (HSF’er) (13). Hos hvirveldyr er der hidtil blevet identificeret fire forskellige HSF’er. Eksistensen af flere HSF’er tyder på, at der er funktionelle forskelle mellem HSF’erne. I modsætning til HSF1 og HSF3 aktiveres HSF2 ikke som reaktion på klassiske stress-stimuli. HSF1 viser imidlertid de typiske træk ved stressinducerbarhed, DNA-binding, oligomerisering og nukleær lokalisering som reaktion på miljømæssige stressfaktorer som f.eks. forhøjede temperaturer og eksponering for cadmiumsulfat og aminosyreanaloger. Under genekspression formidles transaktivering af hedeshockgener af interaktionen mellem HSF1 og det hedeshockelement, der findes i promotoren for alle HSP-generne. Ved ikke stressende temperaturer er HSF1 til stede i cytosolen som et inaktivt, monomer protein, der er bundet af HSP70 og HSP90 (Fig. 2). Efter et varmestød rekrutteres HSP70 og HSP90 til at binde denaturerede proteiner og frigøres derfor fra HSF1. Det ubundne HSF1 lokaliseres til kernen, trimeriseres og opnår DNA-bindingsevne. HSF1 bliver fosforyleret ved serinrester, efterfulgt af transaktivering af HSP-gener, herunder HSP70 og HSP90. Efterfølgende reguleres HSF1’s aktivitet negativt via øget binding af de nyligt syntetiserede HSP70 og HSP90 til HSF1. Den centrale proces for cellulær temperatursensorering er derfor ligevægten mellem bindingen af frie HSP’er til HSF1 eller til stress-denaturerede proteiner.

Celledød: apoptose og nekrose

Udsættelse af celler for varme kan resultere i apoptose eller nekrose afhængig af den anvendte temperatur. Det mest interessante er, at tærskeltemperaturen for apoptoseinduktion på celleniveau svarer til den sikkert tolerable øvre tærskelværdi for systemisk kernetemperatur hos mennesker. For at inducere nekrose skal der anvendes højere temperaturer end dem, der inducerer apoptose, in vitro (10). Ekspression af små HSP’er eller den inducerbare HSP70 har vist sig at øge overlevelsen af pattedyrsceller, der udsættes for mange typer stimuli som f.eks. varme eller andre former for apoptotisk stress (1). Selv om det må antages, at den antinekrotiske funktion er forbundet med chaperonfunktionen, især for HSP70 og HSP27, er den nøjagtige mekanisme for den antiapoptotiske funktion af begge HSP’er ikke helt klar. Der synes at være flere muligheder for, at HSP70 kan interagere med apoptotiske veje. HSP70 interagerer angiveligt med Apaf-1 og forhindrer derved dets interaktion med procaspase-9 og i sidste ende caspaseafhængig apoptose. For nylig er det blevet påvist, at HSP70 også deltager i caspase-uafhængige apoptotiske hændelser via specifik interaktion med den apoptoseinducerende faktor, som frigives fra mitokondrier tidligt i den apoptotiske proces.

Koldchokrespons

Koldstress ændrer lipidsammensætningen af cellemembraner og undertrykker proteinsyntesens hastighed og celleproliferation. Et sæt proteiner kaldet CSP udtrykkes dog i højere grad fra en temperatur på 32 °C. Hypotermi inducerer ekspressionen af RNA-bindende proteiner som cold-inducible RNA-binding protein (CIRP), det første CSP, der er identificeret i pattedyrceller, og RNA-binding motiv protein 3 (4, 12). CIRP, der minder om HSP, udtrykkes også ved 37 °C og er udviklingsreguleret og fungerer muligvis som en RNA-chaperon. Cellulær og molekylær biologi af pattedyrceller ved 32°C er et nyt område, der forventes at få betydelige konsekvenser for fysiologien, f.eks. i testikler og hud, hvor celletemperaturerne typisk er henholdsvis 30-34°C og ~33°C.

HSP’er er forbindelsen mellem omgivelsestemperaturen og den cellulære funktion

HSP’erne og CSP’erne er evolutionært set det mest bevarede respons på temperaturændringer. Selv om proteinerne blev opdaget for længe siden, og disse proteiners molekylære funktioner er mere og mere forstået, er forbindelsen mellem temperatur/HSP/CSP-medierede virkninger og cellulære funktioner mindre udforsket. Når celler udsættes for forhøjede temperaturer, påvirker det ikke kun HSP-ekspression og -aktivitet, men også HSP’ernes interaktion med partnerproteiner. For eksempel påvirker øget HSP90-ekspression og -aktivitet ved forhøjede temperaturer in vitro eller in vivo stabiliteten og aktiviteten af transkriptionsfaktorer som glukokortikoidreceptoren eller den hypoxi-inducerbare faktor-1α. Den omgivende temperatur påvirker dermed genekspressionen i første omgang via en direkte aktivering af varmeinducerbare gener og efterfølgende indirekte via ændret HSP-ekspression og -aktivitet.

Flere udsigter

Der er behov for yderligere undersøgelser for at bestemme indflydelsen af temperaturændringer i det homøoterme legeme på cellulær funktion og genekspression, da man i de fleste in vitro-undersøgelser blot simulerer en kernetemperatur på 37 °C i kroppen. Denne temperatur repræsenterer imidlertid kun kernen af vores krop og negligerer de dynamiske temperaturændringer i andre dele under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Betydningen af en præcis temperaturregulering hos homøotermer illustreres bedst i testiklerne. Selv små stigninger i den scrotale temperatur (som normalt er 30-34 °C) er forbundet med infertilitet. Dette kan til dels tilskrives højere ekspression af HSP90-proteiner og p53-medieret celledød samt nedsat CSP-ekspression. Dette er sandsynligvis et af de mest dramatiske eksempler på behovet for temperaturtilpasning for at “befrugte” vores planet.