Regentin von Schottland werden
Nach dem Tod von Jakobus glaubte Maria von Guise, dass sie zur Regentin ernannt werden würde, aber die Rolle wurde an James Hamilton, Earl of Arran, vergeben. Arran war ein Befürworter des protestantischen Englands. Er schlug vor, dass die junge Maria den englischen Prinzen Edward heiraten sollte, sobald sie 10 Jahre alt war, was Maria von Guise jedoch ablehnte. Heinrich VIII. von England begann eine Reihe wilder Angriffe auf Schottland, die oft als „rough wooing“ bezeichnet werden und darauf abzielten, die Schotten zu zwingen, die Heirat zuzulassen. Als Reaktion darauf arrangierte Maria von Guise 1548 eine Reise der jungen Königin Maria nach Frankreich, wo sie für die Heirat mit dem Dauphin Francois vorbereitet wurde, was die Beziehungen zu Frankreich weiter stärkte. Im Gegenzug unterstützten die Franzosen die Schotten militärisch.
Erst am 12. April 1554, nach mehreren Jahren der Unruhen mit England, gelang es Maria von Guise schließlich, Lord Arran die Kontrolle zu entreißen und sich zur Königin und Regentin von Schottland zu machen. Während ihrer Zeit als Regentin von Schottland sah sich Maria von Guise ständigen Konflikten ausgesetzt. Ihr Ziel war es, Schottland zu modernisieren und es gleichzeitig katholisch und frei von englischer Einmischung zu halten, aber es gab viele schottische Anhänger Englands und der protestantischen Bewegung, die sich ihren Bemühungen widersetzten.
Die protestantische Reform war zu dieser Zeit stark. Einer dieser Reformer war John Knox, der gegen Marias Regentschaft predigte und sie stürzen wollte, um die protestantische Kirche in Schottland zu etablieren. Angeführt von einer Gruppe von Adligen, den Lords of the Congregation, rebellierten die Anhänger Englands weiterhin gegen Maria von Guise. Sie misstrauten ihrer fortgesetzten Verbindung mit dem katholischen Frankreich, die durch die Heirat ihrer Tochter mit Francois im Jahr 1558 noch verstärkt wurde.
Die Protestanten gewannen weiter an Stärke und führten Aufstände gegen Maria von Guise an. Maria stellte sich am 22. Mai 1559 in Perth den protestantischen Lords of the Congregation, musste sich aber nach Edinburgh zurückziehen, wo sie mit Hilfe französischer Truppen die Stadt zurückeroberte, nachdem Knox und die protestantischen Reformatoren ihre Absetzung gefordert hatten.
Zu allem Überfluss schickte England, das nun von Königin Elisabeth I. regiert wurde, weiterhin Verstärkung, um die französischen Soldaten aus Schottland zu vertreiben, und es kam zu sporadischen Kämpfen.