Skócia régensévé válása
Jakab halála után Guise-i Mária azt hitte, hogy ő lesz a régens, de a szerepet James Hamilton, Arran grófja kapta meg. Arran a protestáns Anglia támogatója volt. Megállapodást kötött, hogy a fiatal Mária 10 éves korában feleségül menjen Edward angol herceghez, amit Guise-i Mária elutasított. VIII. Henrik angol király kegyetlen támadások sorozatába kezdett Skócia ellen, amelyet gyakran durva udvarlásként emlegetnek, és amelynek célja az volt, hogy a skótokat a házasság engedélyezésére kényszerítse. Válaszul 1548-ban Guise-i Mária elintézte, hogy a fiatal Mária királynő Franciaországba utazzon, és felkészüljön arra, hogy feleségül menjen Francois dauphinhez, tovább erősítve a kapcsolatokat Franciaországgal. A franciák cserébe katonai támogatást nyújtottak a skótoknak.
Csak 1554. április 12-én, az Angliával való többéves viszálykodás után sikerült Guise Máriának végre kicsikarnia az irányítást Lord Arran kezéből, és Skócia régenskirálynőjévé nevezték ki. Skócia régenseként töltött ideje alatt Guise Mária állandó konfliktusokkal nézett szembe. Célja az volt, hogy modernizálja Skóciát, miközben katolikus és az angol beavatkozástól mentes maradjon, de sok skót támogatója volt Angliának és a protestáns mozgalomnak, akik ellenálltak törekvéseinek.
A protestáns reform erős volt abban az időben. Az egyik ilyen reformer John Knox volt, aki Mária régenssége ellen prédikált, és meg akarta őt buktatni, hogy megalapítsa a protestáns egyházat Skóciában. A Lords of the Congregation nevű nemesi csoport vezetésével az Anglia-pártiak továbbra is lázadtak Guise-i Mária ellen. Gyanakodtak a katolikus Franciaországhoz fűződő további kapcsolataira, amelyeket lányának 1558-ban Francoisszal kötött házassága erősített meg.
A protestánsok tovább erősödtek, és lázadásokat vezettek Guise-i Mária ellen. Mária 1559. május 22-én Perthnél szembeszállt a protestáns kongregáció lordjaival, de kénytelen volt visszavonulni Edinburghba, ahol francia csapatok segítségével visszafoglalta a várost, miután Knox és a protestáns reformerek a trónfosztását követelték.
A helyzetet súlyosbította, hogy Anglia, amelyet immár I. Erzsébet királynő irányított, továbbra is erősítést küldött a francia katonák Skóciából való eltávolítására, és a szórványos harcok folytatódtak.