Skotlannin regentiksi
Jaakobin kuoleman jälkeen Mary of Guise uskoi, että hänestä tehtäisiin regentti, mutta rooli annettiin Arranin jaarlin James Hamiltonin tehtäväksi. Arran oli protestanttisen Englannin kannattaja. Hän teki sopimuksen, jonka mukaan nuori Mary nai Englannin prinssi Edwardin, kun hän täytti 10 vuotta, minkä Mary of Guise hylkäsi. Englannin Henrik VIII aloitti Skotlantiin villien hyökkäysten sarjan, jota kutsutaan usein karkeaksi kosiskeluksi ja jonka tarkoituksena oli pakottaa skotit sallimaan avioliitto. Vastauksena tähän Maria Guise järjesti vuonna 1548 nuorelle kuningatar Marialle matkan Ranskaan, jossa häntä valmisteltiin naimisiin Dauphin Francois’n kanssa, mikä lujitti entisestään suhteita Ranskaan. Ranskalaiset antoivat vastavuoroisesti sotilaallista tukea skotlantilaisille.
Vasta 12. huhtikuuta 1554, useiden Englannin kanssa useita vuosia kestäneiden levottomuuksien jälkeen, Mary of Guise sai vihdoin väännettyä vallan lordi Arranilta ja hänet nimitettiin Skotlannin regentiksi. Skotlannin regenttinä ollessaan Mary of Guise kohtasi jatkuvia konflikteja. Hänen tavoitteenaan oli nykyaikaistaa Skotlantia pitäen se samalla katolisena ja vapaana englantilaisesta sekaantumisesta, mutta monet skotlantilaiset Englannin ja protestanttisen liikkeen kannattajat vastustivat hänen pyrkimyksiään.
Protestanttinen uudistus oli tuohon aikaan voimakas. Yksi tällainen uudistaja oli John Knox, joka saarnasi Marian regentuuria vastaan ja halusi syrjäyttää hänet ja perustaa protestanttisen kirkon Skotlantiin. Lords of the Congregation -nimisen aatelisryhmän johdolla Englannin kannattajat jatkoivat kapinaan Maria Guisea vastaan. He epäilivät hänen jatkuvia siteitään katoliseen Ranskaan, joita vahvisti hänen tyttärensä avioituminen Francois’n kanssa vuonna 1558.
Protestantit voimistuivat edelleen ja johtivat kapinoita Maria Guisea vastaan. Maria kohtasi protestanttiset kongregaation lordit Perthissä 22. toukokuuta 1559, mutta joutui vetäytymään Edinburghiin, jossa hän valloitti kaupungin takaisin ranskalaisten joukkojen avulla sen jälkeen, kun Knox ja protestanttiset uudistusmieliset olivat vaatineet Maria Guisen syrjäyttämistä.
Pahentaakseen tilannetta Englanti, jota nyt hallitsi kuningatar Elisabet I, lähetti edelleen apuvoimia poistaakseen ranskalaissotilaat pois Skotlannista, ja satunnaiset taistelut jatkuivat.