Sul calore e le cellule e le proteine

La saggezza comune è che le forme di vita superiori sono governate dalla temperatura ambientale, poiché praticamente tutti i processi biochimici sono dipendenti dalla temperatura. Le temperature estreme dell’aria ambiente sulla Terra vanno da -89,2°C (misurate il 21 luglio 1983, Wostock, Antartide) a +58°C (misurate il 13 settembre 1922, Al Azizyah, Libia). Nonostante questi estremi di temperatura, le specie omeotermiche, come gli esseri umani, hanno la capacità di regolare la loro temperatura corporea entro un intervallo ristretto fino a 37°C grazie a meccanismi autonomi di regolazione della temperatura. La capacità di mantenere una temperatura interna relativamente costante ha permesso agli animali omeotermi di essere indipendenti dall’influenza delle fluttuazioni della temperatura ambientale. Inoltre, negli omeotermi sono descritti notevoli adattamenti al caldo e al freddo. Mentre l’acclimatazione al calore si ottiene in poche settimane, per esempio, semplicemente aumentando il tasso di sudorazione, l’acclimatazione al freddo si ottiene solo dopo l’esposizione a un ambiente freddo per anni. La popolazione meglio studiata per quanto riguarda l’acclimatazione al freddo sono i subacquei tradizionali coreani e giapponesi chiamati Ama. Durante il loro lavoro di immersione in acqua di mare fredda a 10°C, sono state osservate temperature rettali che vanno da 37°C a 34,8°C (7). Quando il fisiologo Suki Hong studiò queste donne nei primi anni ’60, il loro tasso metabolico basale durante i mesi invernali, quando si immergevano in acque molto fredde, era significativamente elevato rispetto ai valori osservati durante i mesi più caldi. Per compensare questo deficit calorico, il consumo di cibo è aumentato di ~ 1.000 kcal rispetto ai non subacquei. Inoltre, il tasso di brivido in acqua fredda è stato diminuito rispetto alle donne di controllo non subacqueo. Tuttavia, quando Hong ripeté i suoi studi negli anni ’90, le Ama non mostrarono più l’aumento della capacità metabolica, poiché (fortunatamente) non si immergevano più nei loro tradizionali costumi da bagno di cotone, ma erano dotate di mute per combattere lo stress da freddo.

La temperatura corporea interna degli animali a sangue freddo, i cosiddetti animali poikilotermici, dipende dalla temperatura ambientale. Negli animali poikilotermici, la temperatura è il fattore ambientale più importante che governa la distribuzione delle specie. Gli animali acquatici poikilotermici raggiungono temperature estreme. Il pesce antartico del sottordine teleosteo Nototheniodei è uno stenotermo estremo, che vive nelle acque fredde e termicamente stabili dell’Antartide costiero, dove le temperature vanno da +0,3°C a -1,86°C. Nel 1998, è stato descritto il verme policheta Alvinella pompejana, che vive a temperature idrotermali di profondità superiori a +80°C e ha un gradiente termico di 60°C o più sulla lunghezza del corpo.

Anche se i meccanismi sistemici di adattamento ai cambiamenti di temperatura sono ben noti, molto meno si sa dell’adattamento a livello cellulare o genetico. La vita, vista dalla prospettiva cellulare, mostra elevate variazioni di temperatura anche nei corpi degli omeotermi (Fig. 1). Temperature fino a +45°C possono essere misurate sulla pelle durante l’esposizione al sole, il che equivale alla temperatura del Sahara. I miociti sono esposti a temperature fino a 40°C nel muscolo di lavoro. Le temperature corporee più basse e più alte del nucleo, sopravvissute in casi di ipotermia o ipertermia accidentale, sono rispettivamente ~30°C e ~43°C. Sistematicamente, le temperature sono percepite tramite i recettori del freddo e del caldo sui neuroni somatosensoriali specializzati dei mammiferi. Questi recettori appartengono alla famiglia dei canali ionici a potenziale di recettore transitorio, che convertono gli stimoli di temperatura in potenziali elettrici. A livello cellulare, tuttavia, ogni cellula è in grado di reagire a un cambiamento di temperatura con una maggiore o minore produzione di proteine. Sonna et al. (15) hanno individuato 227 geni upregolati e 168 downregolati (su 12.600 studiati) utilizzando un approccio chip array dopo l’esposizione di cellule mononucleate di sangue periferico a 43°C per 20 minuti. Un sottoinsieme di queste proteine, le proteine da shock termico (HSP), sono specializzate nella protezione delle cellule dai danni indotti dal calore. Simile alla risposta specifica al calore, ogni cellula è in grado di aumentare la produzione di proteine da shock termico (CSP) in risposta a una diminuzione della temperatura.

Nel 1962, Ritossa ha scoperto le HSP nel suo lavoro pionieristico. Dopo un aumento della temperatura in un’incubatrice contenente colture di Drosophila, egli osservò notevoli cambiamenti nei modelli di sbuffo cromosomico, cioè i modelli di attività genica dei cromosomi politenici nelle ghiandole salivari larvali. Oggi, è ben noto che in risposta a molti stress, tra cui il calore, le condizioni di ossidazione e l’esposizione a composti tossici, tutte le cellule producono un insieme comune di HSP. Il nome di queste proteine, tuttavia, deriva dal primo fattore scatenante (cioè il calore) che è stato identificato come l’aumento della loro sintesi. L’aumento dell’espressione delle HSP è mediato a più livelli: sintesi dell’mRNA, stabilità dell’mRNA ed efficienza di traduzione. Esperimenti con varie specie hanno dimostrato che l’aumento dell’espressione di queste proteine può proteggere l’organismo dai danni indotti dallo stress. Inoltre, le cellule a cui è stato dato un preshock non letale che induce HSP sopravvivono successivamente a un’esposizione altrimenti letale a temperature elevate. Sorprendentemente, i modelli di espressione delle HSP mostrano alti livelli di conservazione tra le diverse specie. Si pensa quindi che la risposta allo shock termico sia praticamente universale tra gli organismi. Tuttavia, in due casi di pesci esposti ad ambienti freddi e termicamente stabili (Hydra oligatis e Trematomus bernacchii), non è stata rilevata alcuna risposta allo shock termico.

Ci sono numerosi esempi che dimostrano che l’espressione delle HSP può variare con la temperatura ambientale negli esseri umani, nonostante la loro capacità di mantenere una temperatura corporea costante. L’aumento della sintesi di HSP è stato osservato in vivo durante l’esercizio nel muscolo cardiaco a seconda della temperatura ambientale che influenza gli adattamenti miocardici (6). I cambiamenti nell’espressione di HSP72 nei leucociti sono associati all’adattamento all’esercizio in condizioni di alta temperatura ambientale. L’importanza delle HSPs per l’adattamento sistemico ambientale è ben dimostrata soprattutto negli animali poikilotermici. Questi studi mostrano anche che la temperatura alla quale i geni HSP sono attivati è soggetta ad acclimatazione termica in funzione della stagione o di altri cambiamenti nella temperatura ambientale media. Collettivamente, le HSP si sono evolute come proteine generali indotte dallo stress per mantenere l’integrità cellulare (11). Questo meccanismo di resistenza, tuttavia, non avviene solo in situazioni patofisiologiche, ma è anche adattato nella fisiologia dei mammiferi, per esempio nella resistenza osmotica dei cheratinociti o delle cellule renali, dove le condizioni osmotiche fisiologiche (attraverso il cambiamento di umidità o l’accumulo di cloruro di sodio/urea, rispettivamente) provocano una maggiore espressione di HSPs (2).

HSPs e chaperoni molecolari

In condizioni normali (non stressanti), i chaperoni molecolari assistono nel ripiegamento di routine e nella compartimentazione delle proteine appena sintetizzate, e prendono anche parte ad una varietà di altre funzioni cellulari. Durante lo stress termico o altre forme di stress, le HSP indotte dal calore si legano alle proteine denaturate, impedendo così la loro aggregazione e aiutando il loro ripiegamento in stati nativi e funzionali dopo il ripristino della temperatura ambiente. Le HSP sono state classificate nelle cellule eucariotiche in base al loro peso molecolare. Ad oggi, ci sono sei famiglie HSP identificate (HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40, e le piccole HSP). Poiché l’espressione di alcuni membri delle famiglie HSP è aumentata con la fame di glucosio, queste proteine sono chiamate proteine regolate dal glucosio. Alcune HSP, scoperte per la prima volta indipendentemente dal loro ruolo di proteine dello stress (come l’ubiquitina o l’αB-cristallina) portano i loro nomi particolari. Una panoramica delle famiglie di proteine chaperone e della loro struttura e funzione è data nella tabella 1. HSP90 e HSP70 in particolare svolgono un ruolo importante nel mantenimento della funzione cellulare in condizioni di non stress e di stress.

Famiglia HSP90

HSP90s sono proteine altamente conservate, che rappresentano l’1-2% dell’intero contenuto proteico cellulare. HSP90 comprende tre domini strutturali identificati dalla digestione proteolitica. Il dominio NH2-terminale di ~25 kDa è collegato a una regione COOH-terminale altamente conservata di ~55 kDa da un linker carico, che è variabile in lunghezza e composizione tra le specie e le isoforme. Sono state descritte due tasche di legame all’ATP, una situata nel NH2-terminale e una nella regione COOH-terminale. In seguito al legame con l’ATP o al calore, HSP90 passa da una forma in cui i due domini NH2-terminali sono separati nel dimero a una in cui sono associati, generando una struttura toroidale del dimero. Si pensa che questo cambiamento conformazionale sia responsabile del legame del substrato. HSP90 agisce come un chaperone molecolare ATP-dipendente coinvolto nel ripiegamento e nell’attivazione di un numero sconosciuto di proteine substrato, compresi i recettori degli ormoni steroidei, le protein chinasi e i fattori di trascrizione (14). La formazione del complesso di queste proteine clienti con HSP90 è un prerequisito per la loro stabilità e funzionalità. Pertanto, i chaperon appartenenti alla famiglia HSP90 sono attori chiave negli eventi cellulari, come la replicazione del DNA, la trascrizione dell’RNA, il ripiegamento delle proteine, la maturazione, la traslocazione attraverso il reticolo endoplasmatico e le membrane mitocondriali, la proteolisi e la segnalazione cellulare. HSP90 mostra una forte specificità per le sue proteine clienti. HSP90 da sola, tuttavia, non è in grado di promuovere il ripiegamento e/o l’attivazione di nessuna delle sue proteine substrato conosciute. Per una piena attività, è necessaria l’interazione di HSP90 con altre HSP e co-caperoni. Nel caso del recettore del progesterone, sono coinvolte almeno altre sette proteine (HSP70, Hip, Hop, immunofiline e p23). Sulla base del modello del recettore del progesterone, il substrato è ciclico tra un complesso precoce (contenente HSP70 e Hop), un complesso intermedio (contenente HSP70, Hop, e un dimero HSP90), e il complesso maturo (contenente un dimero HSP90 e p23) con la necessità di idrolisi dell’ATP. L’importanza di HSP90 per le funzioni cellulari è dimostrata dall’uso di antagonisti specifici di HSP90 come la geldanamicina (GA) che occupano la tasca di legame ATP di HSP90, impedendo così il ciclo dell’eterocomplesso HSP90. Le cellule trattate con GA mostrano deficit nella crescita cellulare così come nella stabilità e nell’attivazione delle protein chinasi e dei fattori di trascrizione (9). Il significato della funzione di chaperone di HSP90 per la fisiologia cellulare è meglio esemplificato dalla sua interazione con i fattori di trascrizione. Dal momento che HSP90 chaperon il fattore di trascrizione responsabile dell’espressione genica ossigeno-dipendente, cioè il fattore ipossia-inducibile-1α, le cellule trattate con GA sono compromesse nella risposta fisiologica delle cellule ad una diminuzione della tensione di ossigeno.

Famiglia HSP70

Le proteine 70-kDa legate allo shock termico comprendono una famiglia di chaperon molecolari altamente conservati che regolano il ripiegamento delle proteine in condizioni normali e di stress (3). HSP70, come HSP90, è una delle più abbondanti di queste proteine, rappresentando fino all’1-2% delle proteine cellulari totali. Le proteine HSP70 promuovono il ripiegamento delle catene nascenti sui ribosomi, la traslocazione delle proteine attraverso le membrane e la protezione alle alte temperature attraverso l’interazione con le superfici idrofobiche esposte delle proteine non piegate o parzialmente piegate. Le proteine HSP70 contengono due domini, un dominio ATPasi NH2-terminale e un dominio COOH-terminale che lega i peptidi. Il dominio di legame al peptide di HSP70 lega un peptide di sette residui in una conformazione estesa tra un sottodominio β-sheet e un sottodominio α-elico. Si pensa che il legame dell’ATP al dominio ATPasi inneschi il rilascio del substrato inducendo il dominio α a piegarsi verso l’alto in una giunzione flessibile vicino al centro della lunga elica che si estende sul peptide. È stato dimostrato che i co-chaperoni di HSP70, come Hip, Hop, HSP40 e Bag-1, giocano un ruolo importante nel modulare l’attività di HSP70 e la specificità del substrato proteico. Hip è una proteina citosolica di 50 kDa che è stata trovata per interagire con il dominio ATPasi dei membri della famiglia HSP70 e migliorare l’interazione del substrato. Hop è un co-chaperone unico che ha la capacità di interagire con entrambi i macchinari chaperon HSP70 e HSP90 in vari sistemi. In assenza di HSP40 e ATP, HSP70 si lega preferenzialmente ai peptidi e alle proteine denaturate. Tuttavia, in presenza di HSP40, HSP70 esibisce una gamma più ampia di specificità del substrato. Bag-1 è stata originariamente scoperta come una proteina associata a Bcl-2. Oltre alla sua interazione con i membri antiapoptotici della famiglia delle proteine Bcl-2, Bag-1 interagisce anche specificamente con HSP70. Durante le condizioni di stress, si riscontra un’aumentata formazione di complessi Bag-1-HSP70. La generazione di interruzioni geniche mirate del gene HSP70.1 o HSP70.3 sottolinea l’importanza di HSP70 nel mantenimento della termotolleranza acquisita e della ridotta sensibilità all’apoptosi indotta dal calore (8).

HSPs: il termometro cellulare

L’espressione inducibile di HSP è regolata dai fattori di trascrizione dello shock termico (HSFs) (13). Nei vertebrati, quattro diversi HSF sono stati identificati finora. L’esistenza di più HSFs suggerisce differenze funzionali degli HSFs. In contrasto con HSF1 e HSF3, HSF2 non si attiva in risposta a stimoli di stress classici. HSF1, tuttavia, mostra le tipiche caratteristiche di inducibilità allo stress, legame al DNA, oligomerizzazione e localizzazione nucleare in risposta a fattori di stress ambientali come le temperature elevate e l’esposizione al solfato di cadmio e agli analoghi degli aminoacidi. Durante l’espressione genica, la transattivazione dei geni dello shock termico è mediata dall’interazione tra HSF1 e l’elemento dello shock termico presente nel promotore di tutti i geni HSP. A temperature non stressanti, HSF1 è presente nel citosol come una proteina monomerica inattiva che è legata da HSP70 e HSP90 (Fig. 2). In seguito allo shock termico, HSP70 e HSP90 vengono reclutate per legare le proteine denaturate e quindi vengono rilasciate da HSF1. L’HSF1 non legato si localizza nel nucleo, si trimerizza e acquisisce la capacità di legare il DNA. HSF1 viene fosforilato ai residui di serina, seguito dalla transattivazione dei geni HSP tra cui HSP70 e HSP90. Successivamente, l’attività di HSF1 è regolata negativamente attraverso un aumento del legame di HSP70 e HSP90 appena sintetizzate a HSF1. Il processo centrale per il rilevamento della temperatura cellulare è quindi l’equilibrio tra il legame delle HSP libere a HSF1 o alle proteine denaturate dallo stress.

Morte cellulare: apoptosi e necrosi

Esporre le cellule al calore può provocare apoptosi o necrosi a seconda della temperatura applicata. La cosa più interessante è che la temperatura di soglia dell’induzione dell’apoptosi a livello cellulare è equivalente alla soglia superiore tollerabile in sicurezza della temperatura centrale sistemica negli esseri umani. Per l’induzione della necrosi, devono essere applicate in vitro temperature più alte di quelle che inducono l’apoptosi (10). È stato dimostrato che l’espressione di piccole HSP o della HSP70 inducibile migliora la sopravvivenza delle cellule di mammiferi esposte a numerosi tipi di stimoli, come il calore o altre forme di stimoli di stress apoptotico (1). Mentre si deve supporre che la funzione antinecrotica sia collegata alla funzione di chaperone, specialmente di HSP70 e HSP27, il meccanismo esatto della funzione antiapoptotica di entrambe le HSP non è del tutto chiaro. Sembrano esserci molteplici possibilità per HSP70 di interagire con i percorsi apoptotici. HSP70 sembra interagire con Apaf-1, impedendo così la sua interazione con procaspase-9 e infine l’apoptosi caspasi-dipendente. Recentemente, è stato dimostrato che HSP70 partecipa anche agli eventi apoptotici indipendenti dalla caspasi attraverso un’interazione specifica con il fattore induttore di apoptosi, che viene rilasciato dai mitocondri all’inizio del processo apoptotico.

La risposta allo shock termico

Lo stress da freddo cambia la composizione lipidica delle membrane cellulari e sopprime il tasso di sintesi proteica e la proliferazione cellulare. Tuttavia, un insieme di proteine chiamate CSP è espresso a livelli più alti a partire da una temperatura di 32°C. L’ipotermia induce l’espressione di proteine leganti l’RNA come la cold-inducible RNA-binding protein (CIRP), la prima CSP identificata nelle cellule dei mammiferi, e la RNA-binding motif protein 3 (4, 12). Ricordando la HSP, CIRP è anche espressa a 37°C e regolata nello sviluppo, probabilmente lavorando come un chaperon dell’RNA. La biologia cellulare e molecolare delle cellule dei mammiferi a 32°C è una nuova area che dovrebbe avere notevoli implicazioni per la fisiologia, per esempio nei testicoli e nella pelle, dove le temperature delle cellule sono tipicamente 30-34°C e ~33°C, rispettivamente.

Le HSP sono il collegamento tra la temperatura ambientale e la funzione cellulare

Le HSP e le CSP sono evolutivamente la risposta più conservata ai cambiamenti di temperatura. Anche se le proteine sono state scoperte molto tempo fa e le funzioni molecolari di queste proteine sono sempre più comprese, il legame tra gli effetti mediati dalla temperatura/HSP/CSP e le funzioni cellulari è meno esplorato. L’esposizione delle cellule a temperature elevate influenza non solo l’espressione e l’attività delle HSP, ma anche l’interazione delle HSP con le proteine partner. Per esempio, l’aumento dell’espressione e dell’attività di HSP90 mediante temperature elevate in vitro o in vivo influenza la stabilità e l’attività di fattori di trascrizione come il recettore dei glucocorticoidi o il fattore 1α inducibile dall’ipossia. La temperatura ambiente influenza quindi l’espressione genica inizialmente attraverso un’attivazione diretta dei geni termoinducibili e successivamente indirettamente attraverso l’espressione e l’attività alterata di HSP.

Altre prospettive

Sono necessari ulteriori studi per determinare l’influenza dei cambiamenti di temperatura nel corpo omeotermico sulla funzione cellulare e l’espressione genica, poiché nella maggior parte degli studi in vitro viene simulata semplicemente la temperatura del corpo centrale di 37°C. Questa temperatura, tuttavia, rappresenta solo il nucleo del nostro corpo e trascura i cambiamenti di temperatura dinamici in altre parti in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. L’importanza di una precisa regolazione della temperatura negli omeotermi è meglio esemplificata nel testicolo. Anche lievi innalzamenti della temperatura scrotale (che normalmente è di 30-34°C) sono associati all’infertilità. Questo è in parte attribuito a una maggiore espressione delle proteine HSP90 e alla morte cellulare mediata da p53, così come alla diminuzione dell’espressione di CSP. Questo è probabilmente uno degli esempi più drammatici della necessità di adattamento della temperatura per “fertilizzare” il nostro pianeta.