Beroende av regent av Skottland
Efter Jakobs död trodde Mary of Guise att hon skulle bli regent, men rollen gavs till James Hamilton, Earl of Arran. Arran var en anhängare av det protestantiska England. Han gjorde en överenskommelse om att den unga Mary skulle gifta sig med Englands prins Edward när hon fyllde 10 år, vilket Mary of Guise förkastade. Henrik VIII av England inledde en serie brutala attacker mot Skottland, ofta kallade den grova uppvaktningen, som syftade till att tvinga skottarna att tillåta äktenskapet. Som svar på detta ordnade Maria av Guise 1548 att den unga drottning Maria skulle resa till Frankrike och förberedas för att gifta sig med Dauphin Francois, vilket stärkte banden med Frankrike ytterligare. Fransmännen gav i gengäld militärt stöd till skottarna.
Det var inte förrän den 12 april 1554, efter flera års oroligheter med England, som Maria av Guise äntligen kunde rycka ifrån sig kontrollen från lord Arran och utnämnas till drottningregent av Skottland. Under sin tid som regent av Skottland stod Maria av Guise inför ständiga konflikter. Hennes mål var att modernisera Skottland och samtidigt hålla landet katolskt och fritt från engelsk inblandning, men det fanns många skotska anhängare av England och den protestantiska rörelsen som motsatte sig hennes ansträngningar.
Den protestantiska reformen var stark vid den här tiden. En sådan reformator var John Knox, som predikade mot Marias regentskap och ville störta henne för att etablera den protestantiska kyrkan i Skottland. Under ledning av en grupp adelsmän som kallades Lords of the Congregation fortsatte de pro-engelska anhängarna att göra uppror mot Maria av Guise. De var misstänksamma mot hennes fortsatta band med det katolska Frankrike, som stärktes genom hennes dotters giftermål med Francois 1558.
Protestanterna fortsatte att vinna styrka och ledde revolter mot Maria av Guise. Maria mötte de protestantiska kongregationsherrarna i Perth den 22 maj 1559, men var tvungen att dra sig tillbaka till Edinburgh där hon med hjälp av franska trupper återtog staden, efter att Knox och de protestantiska reformatorerna hade krävt att hon skulle avsättas.
För att göra saken värre fortsatte England, som nu styrdes av drottning Elisabet I, att skicka förstärkningar för att avlägsna de franska soldaterna från Skottland och sporadiska strider fortsatte.