Becoming Regent of Scotland
Após a morte de James, Mary of Guise acreditava que seria feita regente, mas o papel foi dado a James Hamilton, Conde de Arran. Arran era um apoiante da Inglaterra Protestante. Ele fez um acordo para que a jovem Maria casasse com o Príncipe Eduardo da Inglaterra quando ela chegasse aos 10 anos de idade, o que Maria de Guise rejeitou. Henrique VIII da Inglaterra embarcou numa série de ataques selvagens à Escócia, muitas vezes chamados de cortejos rudes, concebidos para forçar os escoceses a permitir o casamento. Em resposta, em 1548 Mary of Guise providenciou para que a jovem rainha Mary viajasse para França e fosse preparada para casar com o Dauphin François, fortalecendo ainda mais os laços com a França. Os franceses, em troca, deram apoio militar aos escoceses.
Só a 12 de Abril de 1554, depois de vários anos de agitação com a Inglaterra, é que Mary of Guise conseguiu finalmente obter o controlo do Lord Arran e ser nomeada Rainha Regente da Escócia. Durante o seu tempo como Regente da Escócia, Mary of Guise enfrentou um conflito constante. Seu objetivo era modernizar a Escócia, mantendo-a católica e livre da interferência inglesa, mas havia muitos apoiadores escoceses da Inglaterra e do movimento protestante que resistiram aos seus esforços.
A reforma protestante foi forte na época. Um desses reformadores foi John Knox, que pregava contra a regência de Mary e queria derrubá-la para estabelecer a Igreja Protestante na Escócia. Liderados por um grupo de nobres chamados os Senhores da Congregação, os partidários pró-Inglaterra continuaram a se rebelar contra Mary of Guise. Eles suspeitavam dos contínuos laços dela com a França Católica, fortalecidos pelo casamento de sua filha com François em 1558.
Os protestantes continuaram a ganhar força e lideraram revoltas contra Mary of Guise. Mary enfrentou os Senhores Protestantes da Congregação em Perth em 22 de maio de 1559, mas teve que se retirar para Edimburgo onde, com a ajuda das tropas francesas, reconquistou a cidade, depois que Knox e os reformadores protestantes pediram que ela fosse deposta.
Para piorar a situação, a Inglaterra, agora governada pela Rainha Isabel I, continuou a enviar reforços para retirar os soldados franceses da Escócia e os combates esporádicos continuaram.