Extrakce RNA pomocí TRIzolu (název produktu Invitrogen) nebo ekvivalentního TRI (název produktu Sigma-Aldrich) je běžná metoda extrakce celkové RNA z buněk založená na výzkumu Chomczynski P, Sacchi N. 1987 a znovu přezkoumána autory v roce 2006 . Trvá o něco déle než metody založené na kolonách, jako je RNAeasy, ale má vyšší kapacitu a může poskytnout více RNA. Spolu s chaotropními lyzačními pufry je obecně považována za metodu, která poskytuje nejkvalitnější RNA.
Princip
- guanidinium isothiokyanát (silný proteinový denaturant) -> inaktivace RNáz
- kyselý fenol/chloroform -> rozdělení RNA do vodného supernatantu pro separaci
Poznámka: nízké pH je rozhodující, protože při neutrálním pH se DNA, nikoli RNA rozděluje do vodné fáze. Zkontrolujte pH starých činidel TRIZOL/TRI!
Reagencie
- Činidlo TRIzol nebo TRI
Pokud si chcete vyrobit vlastní činidla, viz zde Extrakce RNA pomocí vlastnoručně vyrobených činidel s guanidiniovou kyselinou a fenolem
- 0,8 M citronan sodný / 1,5 M citronan sodný.2 M NaCl
- izopropanol (2-propanol)
- chloroform
- 75% EtOH v DEPC H2O
- Voda bez nákazy (filtrovaná nebo DEPC)
Kroky
lyzace buněk
Lýza buněk trvá jen několik minut na jamku, ale homogenizace tkáně může trvat 10-20 minut na vzorek v závislosti na tom, jak je tkáň houževnatá.
- (promytí PBS)
- přidejte trizol(buněčná lýza)
1ml / 3.Jamka o průměru 5 cm (6 jamek) 5ml / 75 ml láhev
- homogenizovat několikerým pipetováním (mechanická lýza)
alternativa pro zkumavky: vortex 1 min. alternativa pro tkáně:
- (5 min při RT pro úplnou disociaci nukleoproteinových komplexů)
RNA je stabilní v trizolu, který deaktivuje RNázy. V tomto okamžiku můžete udělat přestávku a ponechat vzorek v trizolu po krátkou dobu nebo jej zmrazit na delší dobu.
fázová separace
15-45 min v závislosti na počtu vzorků a na tom, zda je nutné další promývání chloroformem
- přidat chloroform (1/5 objemu trizolu; např.např. 0,2 ml až 1 ml)
- protřepávejte po dobu 15 s (Ecclesův protokol: nevrtejte)
- inkubujte 2-5 min při RT
- otáčejte max. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
pokud centrifugace nebyla dostatečná, interfáze obsahující DNA bude zakalená a špatně zhutněná
Pokud se supernatant jeví jako zakalený, lze zde vložit další krok čištění chloroformem.
- přeneste vodnou horní fázi do nové zkumavky
Dejte pozor, abyste nevsáli bílé rozhraní obsahující DNA. To se rychle stane a povede to ke kontaminaci DNA v přípravě RNA.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
Srážení a promývání RNA
20-40 min v závislosti na počtu vzorků
- přidejte isopropanol (70 % vodné fáze nebo 1/2 objemu trizolu)
- 0,8 M citrátu sodného nebo 1,8 M citrátu sodného.2 M NaCl lze přidat
- (inkubovat 10 min při RT)
- spinovat max. g, 10-15 min, 4 ºC
- odstranit supernatant
- (alternativní srážení RNA – RNeasy od Qiagenu) lepší než srážení alkoholem pro menší množství RNA (menší riziko ztráty miniaturního peletu nukleové kyseliny); také snižuje riziko kontaminace organickým rozpouštědlem
podobné soupravy jako RNeasy: MinElute kit, nebo Affymetrix čištění vzorků
promývání RNA
15-30 min v závislosti na počtu vzorků
- promývání pelet 70% EtOH (přidejte & krátce vortexujte)
70% ethanol připravený s vodou bez RNáz
někteří dávají přednost více než jednomu promývání pelet 70% ethanolem
- spin max. g, 2-10 min, 4ºC
- sušení peletky na vzduchu po dobu 5-10 min
Peletku nepřesušujte, jinak ji nebudete moci znovu rozpustit.
volitelně přidejte inhibitor RNázy
inkubujte při 55-60 C° po dobu 10 min, pokud se obtížně znovu rozpouští
- přeneste do eppendorfské zkumavky
- otáčejte při 4° C, 5 min (pro peletování nerozpuštěného materiálu)
rozpuštění RNA
- rozpusťte pelet v 50-100 µl filtrované nebo DEPC H2O (pozn: DEPC inhibuje RT reakci)
- případně 0.5% SDS
pipetování nahoru a dolů, zahřívání na 55-60 °C po dobu 10 min
Časté chyby
- použití příliš malého množství trizolu; velmi malé objemy se špatně oddělují a pravděpodobně povedou ke kontaminaci
- při odstraňování vodného supernatantu (RNA)
- používejte fenol/chloroform nesprávného pH (musí být kyselý)
- nepracujte pod kapotou (fenol je toxický , chloroform je narkotikum )
Viz také
- Extrakce RNA (centrální, obecná stránka)
Reagencie
- Činidlo TRIZOL (Invitrogen), TRIZOL na wikipedii
- TRI činidlo (Sigmal Aldrich)
Protokoly
- Extrakce RNA pomocí TRIZOL (Stanford)
- Extrakce RNA pomocí TRIZOL (Uni Florida)
- Průvodce řešením problémů při extrakci TRIZOL (Uni Toronto)
- Fenol-chloroformová extrakce nukleových kyselin na Wikipedii
Tipy
- Ambion tipy k extrakci RNA
.