Ekstrakcja RNA przy użyciu TRIzolu (nazwa produktu Invitrogen) lub odpowiednika TRI (nazwa produktu Sigma-Aldrich) jest powszechnie stosowaną metodą ekstrakcji całkowitego RNA z komórek opartą na badaniach Chomczynski P, Sacchi N. 1987 i ponownie przejrzaną przez autorów w 2006 roku . Trwa ona nieco dłużej niż metody oparte na kolumnach, takie jak RNAeasy, ale ma większą wydajność i może dać więcej RNA. Wraz z chaotropowymi buforami lizującymi jest ona ogólnie uważana za metodę, która daje najlepszą jakość RNA.
Zasada
- izotiocyjanian guanidyny (silny środek denaturujący białka) -> inaktywacja RNaz
- kwaśny fenol/chloroform -> podział RNA do wodnego supernatantu w celu oddzielenia
Uwaga: niskie pH jest kluczowe, ponieważ przy neutralnym pH DNA nie RNA rozdziela się do fazy wodnej. Sprawdź pH starych odczynników TRIZOL/TRI!
Odczynniki
- TRIzol lub odczynnik TRI
Jeśli chcesz zrobić własne odczynniki, zobacz tutaj Ekstrakcja RNA przy użyciu samodzielnie wykonanych odczynników guanidinium-acid-phenol
- 0.8 M cytrynian sodu / 1.2 M NaCl
- izopropanol (2-propanol)
- chloroform
- 75% EtOH w DEPC H2O
- woda wolna od rnazy (filtrowana lub DEPC)
Kroki
liza komórek
Liza komórek zajmuje tylko kilka minut na studzienkę, ale homogenizacja tkanki może zająć 10-20 minut na próbkę, w zależności od tego, jak twarda jest tkanka.
- (PBS wash)
- add trizol(cell lysis)
1ml / 3.5 cm średnicy dołka (6 dołków) 5ml / 75 ml butelka
- homogenizować przez kilkakrotne pipetowanie (liza mechaniczna)
alternatywa dla probówek: vortex 1 min alternatywa dla tkanek: rozdrobnić 1 g tkanki w ciekłym azocie w motarze i tłuczku, umieścić tkankę w plastikowej zakręcanej probówce wirówkowej + 15 ml odczynnika TRIzol, inkubować próbki przez 5 min w temp. pokojowej lub 60° C (skalować w zależności od potrzeb)
- (5min w RT dla całkowitej dysocjacji kompleksów nukleoproteinowych)
RNA jest stabilne w trizolu, który dezaktywuje RNazy. W tym momencie można zrobić przerwę utrzymując próbkę w trizolu przez krótki czas lub zamrażając ją na dłużej.
rozdzielanie faz
15-45 min w zależności od ilości próbek i tego czy konieczne jest dodatkowe płukanie chloroformem
- dodaj chloroform (1/5 objętości trizolu; np.np. 0.2ml do 1ml)
- wstrząsać przez 15 sekund (protokół Eccles: nie worteksować)
- inkubować 2-5 min przy RT
- wirować max. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
jeżeli wirowanie nie było wystarczające, interfaza zawierająca DNA będzie mętna i słabo zagęszczona
Jeżeli supernatant wydaje się mętny, można tutaj wprowadzić dodatkowy etap oczyszczania chloroformem.
- przenieść wodną fazę górną do nowej probówki
Uważać, aby nie aspirować białej fazy zawierającej DNA. Szybko to nastąpi i doprowadzi do zanieczyszczenia DNA w preparacie RNA.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
Precypitacja RNA i płukanie
20-40 min w zależności od liczby próbek
- dodać izopropanol (70% fazy wodnej lub 1/2 objętości trizolu)
- 0.8 M cytrynian sodu lub 1.2 M NaCl może być dodany
- (inkubować 10min w RT)
- spin max g, 10-15 min, 4ºC
- usunąć supernatant
- (alternatywne wytrącanie RNA – RNeasy firmy Qiagen) lepsze niż wytrącanie alkoholem dla mniejszych ilości RNA (mniejsze ryzyko utraty minimalnego osadu kwasu nukleinowego); zmniejsza również ryzyko skażenia rozpuszczalnikiem organicznym
podobne zestawy do RNeasy: MinElute kit, lub Affymetrix sample clean-up
RNA wash
15-30 min w zależności od liczby próbek
- wash pellet 70% EtOH (add & vortex briefly)
70% ethanol prepared with RNase-free water
some prefer to wash the pellot more than once with 70% ethanol
- spin max g, 2-10 min, 4ºC
- suszenie na powietrzu peletu przez 5-10 min
Nie przesuszaj peletu, bo nie będziesz w stanie go ponownie rozpuścić.
opcjonalnie dodać inhibitor RNase
inkubować w 55-60 C° przez 10 min, jeśli trudno go ponownie rozpuścić
- transferować do probówki eppendorf
- wirować 4° C, 5 min (aby wytrącić nierozpuszczony materiał)
ponowne rozpuszczenie RNA
- rozpuścić osad w 50-100 µl przefiltrowanej lub DEPC H2O (uwaga: DEPC hamuje reakcję RT)
- alternatywnie, 0.5% SDS
pipetując w górę i w dół, podgrzać do 55-60°C przez 10 min
Częste błędy
- użycie zbyt małej ilości trizolu; bardzo małe objętości są trudne do rozdzielenia i najprawdopodobniej doprowadzą do kontaminacji
- aspirować trochę białej interfazy (DNA) podczas usuwania wodnego supernatantu (RNA)
- stosować fenol/chloroform o niewłaściwym pH (musi być kwaśne)
- nie pracować pod maską (fenol jest toksyczny , chloroform jest narkotykiem )
Zobacz także
- ekstrakcja RNA (centralna, ogólna strona)
Odczynniki
- odczynnik TRIZOL (Invitrogen), TRIZOL na wikipedii
- Odczynnik TRI (Sigmal Aldrich)
Protokoły
- Ekstrakcja RNA za pomocą TRIZOL (Stanford)
- Ekstrakcja RNA za pomocą TRIZOL (Uni Florida)
- Przewodnik rozwiązywania problemów z ekstrakcją TRIZOL (Uni Toronto)
- Fenol-chloroformowa ekstrakcja kwasów nukleinowych w Wikipedii
Porady
- Porady dotyczące ekstrakcji RNA
.