Extragerea ARN cu TRIzol (denumirea produsului Invitrogen) sau echivalentul TRI (denumirea produsului Sigma-Aldrich) este o metodă obișnuită de extragere a ARN total din celule, bazată pe cercetările lui Chomczynski P, Sacchi N. 1987 și revizuită de autori din nou în 2006 . Durează ceva mai mult decât metodele bazate pe coloane, cum ar fi RNAeasy, dar are o capacitate mai mare și poate produce mai mult ARN. Împreună cu tampoanele de liză haotropice, este în general considerată metoda care oferă ARN de cea mai bună calitate.
Principiu
- izotiocianat de guanidiniu (denaturant puternic al proteinelor) -> inactivarea RNazelor
- fenol/cloroform acid -> partiționarea ARN-ului în supernatantul apos pentru separare
Nota: pH-ul scăzut este crucial, deoarece la pH neutru ADN-ul, nu ARN-ul, se partiționează în faza apoasă. Verificați pH-ul vechilor reactivi TRIZOL/TRI!
Reactivi
- Reactiv TRIzol sau reactiv TRI
Dacă doriți să vă faceți singuri reactivii, vedeți aici Extracția ARN-ului folosind reactivi guanidiniu-acid-fenol auto-fabricați
- Citrat de sodiu 0,8 M / 1.2 M NaCl
- isopropanol (2-propanol)
- cloroformă
- 75% EtOH în DEPC H2O
- apă fără raze (filtrată sau DEPC)
Etapele
Liza celulară
Liza celulară durează doar câteva minute pentru fiecare puț, dar omogenizarea țesuturilor poate dura 10-20 de minute per eșantion, în funcție de cât de dur este țesutul.
- (spălare cu PBS)
- adăugați trizol(liză celulară)
1ml / 3.5 cm diametru puț (6 puțuri) flacon de 5ml / 75 ml
- omogenizare prin pipetare de mai multe ori (liză mecanică)
alternativă pentru tuburi: vortex 1 min alternativă pentru țesut: se macină 1 g de țesut în azot lichid într-un mojar și un pisălog, se pune țesutul într-un tub de centrifugare cu capac de plastic cu șurub + 15 ml de reactiv TRIzol, se incubează probele timp de 5 min la temperatura camerei sau la 60° C (se mărește în funcție de necesități)
- (5min la RT pentru disocierea completă a complexelor nucleoproteice)
ARN este stabil în trizol care dezactivează RNazele. Puteți face o pauză în acest moment păstrând proba în trizol pentru un timp scurt sau congelând-o pentru un timp mai îndelungat.
separare în fază
15-45 min în funcție de numărul de probe și dacă este necesară o spălare suplimentară cu cloroform
- adăugați cloroform (1/5 volum de trizol; e.g. 0,2ml până la 1ml)
- agitați timp de 15 sec (protocolul Eccles: nu agitați în vortex)
- incubați 2-5 min la RT
- învârtiți max. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
dacă centrifugarea nu a fost suficientă, interfața care conține ADN va fi tulbure și slab compactată
Dacă supernatantul pare tulbure, se poate introduce aici o etapă suplimentară de curățare cu cloroform.
- transferați faza superioară apoasă într-un nou tub
Aveți grijă să nu aspirați interfața albă care conține ADN. Acest lucru se întâmplă rapid și va duce la contaminarea ADN-ului în prepararea ARN-ului.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
Precipitarea ARN-ului și spălarea
20-40 min în funcție de numărul de probe
- adăugați izopropanol (70% din faza apoasă sau 1/2 volum de trizol)
- 0,8 M citrat de sodiu sau 1.2 M NaCl poate fi adăugat
- (se incubează 10min la RT)
- spin max g, 10-15 min, 4ºC
- se îndepărtează supernatantul
- (precipitare alternativă a ARN – RNeasy de la Qiagen) mai bună decât precipitarea cu alcool pentru cantități mai mici de ARN (mai puțin risc de a pierde un minuscul pellet de acid nucleic); reduce, de asemenea, riscul de contaminare cu solvenți organici
simil kituri similare cu RNeasy: Kitul MinElute, sau de curățare a probelor Affymetrix
Spălare ARN
15-30 min, în funcție de numărul de probe
- spălare pelotă 70% EtOH (adăugați & vortexați scurt)
etanol 70% preparat cu apă fără RNază
unii preferă să spele pelotă de mai multe ori cu etanol 70%
- spin max g, 2-10 min, 4ºC
- secare la aer a peletului timp de 5-10 min
Nu uscați prea mult peletul sau nu veți putea să-l redisolvați.
opțional adăugați inhibitor de RNază
Incubați la 55-60 C° timp de 10 min dacă este greu de redisolvat
- transferați în tub eppendorf
- învârtiți la 4° C, 5 min (pentru a peletiza materialul nedizolvat)
redisolvarea ARN-ului
- dizolvați peletul în 50-100 µl de H2O filtrată sau DEPC (notă: DEPC inhibă reacția RT)
- alternativ, 0.5% SDS
pipetând în sus și în jos, se încălzește la 55-60°C timp de 10 min
Erorile comune
- utilizați prea puțin trizol; volumele foarte mici sunt greu de separat și cel mai probabil vor duce la contaminare
- aspirați o parte din interfața albă (ADN) atunci când îndepărtați supernatantul apos (ARN)
- utilizați fenol/cloroform cu pH-ul greșit (trebuie să fie acid)
- nu lucrați sub hotă (fenolul este toxic , cloroformul este un narcotic )
Vezi și
- Extracția ARN (pagina centrală, generală)
Reactivi
- Reactiv TRIZOL (Invitrogen), TRIZOL pe wikipedia
- Reactiv TRI (Sigmal Aldrich)
Protocoale
- Extracția de ARN cu TRIZOL (Stanford)
- Extracția de ARN cu TRIZOL (Uni Florida)
- Ghid de rezolvare a problemelor pentru extracția cu TRIZOL (Uni Toronto)
- Phenol-chloroform extraction of nucleic acids at Wikipedia
Tips
- Ambion tips on RNA extraction
.