A TRIzol (Invitrogen terméknév) vagy az ezzel egyenértékű TRI (Sigma-Aldrich terméknév) segítségével történő RNS extrakció a sejtekből történő teljes RNS kivonás elterjedt módszere, amely Chomczynski P, Sacchi N. 1987-es kutatásán alapul, és amelyet a szerzők 2006-ban újra felülvizsgáltak. Valamivel hosszabb időt vesz igénybe, mint az oszlopalapú módszerek, például az RNAeasy, de nagyobb kapacitással rendelkezik, és több RNS-t nyerhet. A kaotróp lízispufferekkel együtt általában ezt tartják a legjobb minőségű RNS-t adó módszernek.
Az elv
- guanidinium-izotiocianát (erős fehérje denaturálószer) -> RNázok inaktiválása
- savas fenol/kloroform -> az RNS partícionálása a vizes felülúszóba az elválasztáshoz
Megjegyzés: az alacsony pH döntő, mivel semleges pH-n a DNS nem RNS partícionálódik a vizes fázisba. Ellenőrizze a régi TRIZOL/TRI reagensek pH-ját!
Reagensek
- TRIzol vagy TRI reagens
Ha saját reagenseket szeretne készíteni, lásd itt RNS extrakció saját készítésű guanidinium-sav-fenol reagensekkel
- 0,8 M nátrium-citrát / 1.2 M NaCl
- izopropanol (2-propanol)
- klórform
- 75% EtOH DEPC H2O-ban
- RNázmentes víz (szűrt vagy DEPC)
Lépések
sejtlízis
A sejtlízis csak néhány percet vesz igénybe kutanként, de a szövetek homogenizálása 10-20 percet is igénybe vehet mintánként, attól függően, hogy mennyire kemény a szövet.
- (PBS mosás)
- trizol hozzáadása(sejtlízis)
1ml / 3.5 cm átmérőjű lyuk (6 lyuk) 5ml / 75 ml-es palack
- homogenizálás többszöri pipettázással (mechanikus lízis)
alternatíva csövekhez: vortex 1 perc alternatíva szövetekhez:
- (5 perc RT-n a nukleoprotein komplexek teljes disszociációjához)
RNS stabil a trizolban, amely inaktiválja az RNázokat, az RNS stabil a trizolban, amely inaktiválja az RNázokat. Ezen a ponton szünetet tarthatunk, ha a mintát rövid ideig trizolban tartjuk, vagy hosszabb időre lefagyasztjuk.
fázisszeparáció
15-45 perc a minták számától és attól függően, hogy szükséges-e további kloroformos mosás
- kloroform hozzáadása (1/5 térfogat trizol; e.pl. 0,2 ml – 1 ml)
- 15 másodpercig rázzuk (Eccles protokoll: ne keverjük fel)
- inkubáljuk 2-5 percig RT-n
- spin max. 12000g, 5-15 perc, 2-8°C
ha a centrifugálás nem volt elegendő, a DNS-tartalmú interfázis felhőszerű és rosszul tömörített lesz
Ha a felülúszó zavarosnak tűnik, itt további kloroformos tisztítási lépés illeszthető be.
- a vizes felső fázis új csőbe való átvitele
Vigyázzon, hogy ne szívja le a DNS-tartalmú fehér határfelületet. Ez gyorsan megtörténik, és DNS-szennyeződéshez vezet az RNS-prepben.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
RNS-csapadék és mosás
20-40 perc a minták számától függően
- izopropanol hozzáadása (a vizes fázis 70%-a vagy 1/2 trizol térfogat)
- 0,8 M nátrium-citrát vagy 1.2 M NaCl adható
- (10 perc inkubálás RT-n)
- spin max g, 10-15 perc, 4ºC
- eltávolítani a felülúszót
- (alternatív RNS kicsapás – RNeasy a Qiagen-től) kisebb mennyiségű RNS esetén jobb, mint az alkoholos kicsapás (kisebb a kockázata, hogy elveszik a parányi nukleinsav pellet); csökkenti a szerves oldószerrel való szennyeződés kockázatát is
az RNeasyhez hasonló készletek: MinElute kit, vagy Affymetrix mintatisztítás
RNS mosás
15-30 perc a minták számától függően
- mossa a pelletet 70%-os EtOH-val (hozzáadása & rövid vortexelés)
70%-os etanol RNázmentes vízzel elkészítve
egyesek inkább többször mossák a pelletet 70%-os etanollal
- spin max g, 2-10 perc, 4ºC
- levegőn szárítsuk a pelletet 5-10 percig
Ne szárítsuk túl a pelletet, különben nem fogjuk tudni újra feloldani.
opcionálisan adjunk hozzá RNáz inhibitort
inkubáljuk 55-60 C°-on 10 percig, ha nehezen oldódik újra
- transzferáljuk eppendorf csőbe
- pörgessük 4° C-on, 5 perc (a fel nem oldódott anyag pelletálása)
az RNS újrafeloldása
- a pellet feloldása 50-100 µl szűrt vagy DEPC H2O-ban (megjegyzés: A pelletet 50-100 µl szűrt vagy DEPC H2O-ban kell feloldani): DEPC gátolja az RT reakciót)
- alternatívaként 0.5% SDS
fel és le pipettázás, melegítés 55-60°C-ra 10 percig
Gyakori hibák
- túl kevés trizolt használjunk; nagyon kis térfogatokat nehéz elválasztani, és nagy valószínűséggel szennyeződéshez vezet
- a vizes felülúszó (RNS)
- nem megfelelő pH-jú fenolt/kloroformot használ (savasnak kell lennie)
- nem dolgozik motorháztető alatt (a fenol mérgező , a kloroform kábítószer )
Lásd még
- RNS extrakció (központi, általános oldal)
Reagensek
- TRIZOL reagens (Invitrogen), TRIZOL a wikipédián
- TRI reagens (Sigmal Aldrich)
Protokollok
- RNS extrakció TRIZOL-lal (Stanford)
- RNS extrakció TRIZOL-lal (Uni Florida)
- Troubleshooting guide for TRIZOL extraction (Uni Toronto)
- Phenol-nukleinsavak kloroformos extrakciója a Wikipédián
Tippek
- Ambion tippek az RNS extrakcióhoz