L’estrazione dell’RNA con TRIzol (nome prodotto Invitrogen) o l’equivalente TRI (nome prodotto Sigma-Aldrich) è un metodo comune di estrazione dell’RNA totale dalle cellule basato sulla ricerca di Chomczynski P, Sacchi N. 1987 e rivisto dagli autori nuovamente nel 2006. Richiede un tempo leggermente più lungo rispetto ai metodi a colonna come RNAeasy, ma ha una capacità maggiore e può produrre più RNA. Insieme ai buffer di lisi caotropici è generalmente considerato il metodo che dà la migliore qualità di RNA.
Principio
- isotiocianato di guanidinio (potente denaturante delle proteine) -> inattivazione delle RNasi
- fenolo/cloroformio acido -> partizionamento dell’RNA nel surnatante acquoso per la separazione
Nota: il pH basso è cruciale poiché a pH neutro il DNA non l’RNA si divide nella fase acquosa. Controlla il pH dei vecchi reagenti TRIZOL/TRI!
Reagenti
- Reagente TRI o TRI
Se vuoi fare i tuoi reagenti, vedi qui Estrazione di RNA usando reagenti guanidinio-acido-fenolo autoprodotti
- 0.8 M sodio citrato / 1.2 M NaCl
- isopropanolo (2-propanolo)
- cloroformio
- 75% EtOH in DEPC H2O
- RNase free water (filtered or DEPC)
Steps
cell lysis
La lisi cellulare richiede solo pochi minuti per pozzetto, ma l’omogeneizzazione dei tessuti può richiedere 10-20 minuti per campione a seconda di quanto sia duro il tessuto.
- (lavaggio PBS)
- aggiungere trizol (lisi cellulare)
1ml / 3.5 cm di diametro (6 pozzetti) 5ml / 75 ml bottiglia
- omogeneizzare pipettando più volte (lisi meccanica)
alternativa per tubi: vortex 1 min alternativa per tessuto: macinare 1 g di tessuto in azoto liquido in un mortaio e pestello, mettere il tessuto in una provetta da centrifuga di plastica con tappo a vite + 15 ml di reagente TRIzol, incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente o 60° C (scalare secondo necessità)
- (5min a RT per una completa dissociazione dei complessi nucleoproteici)
L’RNA è stabile nel trizol che disattiva le RNasi. Si può fare una pausa a questo punto mantenendo il campione in trizol per un breve periodo o congelandolo per uno più lungo.
separazione di fase
15-45 min a seconda del numero di campioni e se è necessario un ulteriore lavaggio con cloroformio
- aggiungere cloroformio (1/5 volume di trizol; es.0.2ml a 1ml)
- agitare per 15 sec (protocollo Eccles: non vortexare)
- incubare 2-5 min a RT
- spin max. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
se la centrifugazione non è stata sufficiente l’interfase contenente DNA sarà nuvolosa e poco compatta
Se il surnatante appare torbido un ulteriore passaggio di pulizia con cloroformio può essere inserito qui.
- trasferire la fase superiore acquosa in un nuovo tubo
Fare attenzione a non aspirare l’interfaccia bianca contenente DNA. Questo accade rapidamente e porterà alla contaminazione del DNA nella tua preparazione dell’RNA.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
Precipitazione dell’RNA e lavaggio
20-40 min a seconda del numero di campioni
- aggiungere isopropanolo (70% della fase acquosa o 1/2 volume di trizol)
- 0.8 M citrato di sodio o 1.2 M NaCl può essere aggiunto
- (incubare 10min a RT)
- spin max g, 10-15 min, 4ºC
- rimuovere il surnatante
- (precipitazione alternativa dell’RNA – RNeasy di Qiagen) meglio della precipitazione con alcol per piccole quantità di RNA (meno rischio di perdere un pellet minuscolo di acido nucleico); riduce anche il rischio di contaminazione da solventi organici
kit simili a RNeasy: Kit MinElute, o Affymetrix sample clean-up
lavaggio RNA
15-30 min a seconda del numero di campioni
- lavaggio pellet 70% EtOH (aggiungere & vortex brevemente)
etanolo 70% preparato con acqua RNase-free
alcuni preferiscono lavare il pellet più di una volta con etanolo 70%
- spin max g, 2-10 min, 4ºC
- asciugare all’aria il pellet per 5-10 min
Non asciugare troppo il pellet o non sarai in grado di ridissolverlo.
opzionale aggiungere inibitore di RNasi
incubare a 55-60 C° per 10 min se difficile da ridissolvere
- trasferire in provetta eppendorf
- spin 4° C, 5 min (per sedimento di materiale non disciolto)
risoluzione di RNA
- dissolvere il pellet in 50-100 µl di H2O filtrata o DEPC (nota: DEPC inibisce la reazione RT)
- in alternativa, 0.5% SDS
pipettando su e giù, riscaldare a 55-60°C per 10 min
Errori comuni
- utilizzare troppo poco trizol; volumi molto piccoli sono difficili da separare e molto probabilmente porteranno alla contaminazione
- aspirare un po’ di interfase bianca (DNA) quando si rimuove il surnatante acquoso (RNA)
- usare fenolo/cloroformio del pH sbagliato (deve essere acido)
- non lavorare sotto il cappuccio (il fenolo è tossico, il cloroformio è un narcotico)
Vedi anche
- estrazione dell’RNA (pagina centrale, generale)
Reagenti
- reagente TRIZOL (Invitrogen), TRIZOL su wikipedia
- Reagente TRI (Sigmal Aldrich)
Protocolli
- Estrazione di RNA con TRIZOL (Stanford)
- Estrazione di RNA con TRIZOL (Uni Florida)
- Guida alla risoluzione dei problemi dell’estrazione TRIZOL (Uni Toronto)
- Fenolo-estrazione con cloroformio di acidi nucleici su Wikipedia
Tips
- Consigli di Ambion sull’estrazione di RNA