RNA-extraktion med TRIzol (produktnamn från Invitrogen) eller motsvarande TRI (produktnamn från Sigma-Aldrich) är en vanlig metod för att extrahera totalt RNA från celler, som bygger på forskning av Chomczynski P, Sacchi N. 1987 och som författarna granskade igen 2006 . Den tar något längre tid än kolonnbaserade metoder som RNAeasy, men den har högre kapacitet och kan ge mer RNA. Tillsammans med chaotropa lysisbuffertar anses det i allmänhet vara den metod som ger RNA av bästa kvalitet.
Princip
- guanidiniumisotiocyanat (kraftfullt denatureringsmedel för proteiner) -> inaktivering av RNaser
- sur fenol/klorform -> fördelning av RNA i den vattenhaltiga supernatanten för separering
Anm.: Lågt pH är avgörande, eftersom DNA, inte RNA, vid neutralt pH fördelar sig i den vattenhaltiga fasen. Kontrollera pH i gamla TRIZOL/TRI-reagenser!
Reagenser
- TRIzol eller TRI-reagens
Om du vill göra egna reagenser, se här RNA-extraktion med hjälp av egentillverkade guanidiniumsyrafenol-reagenser
- 0,8 M natriumcitrat / 1.2 M NaCl
- isopropanol (2-propanol)
- kloroform
- 75% EtOH i DEPC H2O
- RNasfritt vatten (filtrerat eller DEPC)
Steg
celllysning
Celllysning tar bara några minuter per brunn, men homogenisering av vävnad kan ta 10-20 minuter per prov beroende på hur hård vävnaden är.
- (PBS tvätt)
- tillsätt trizol(celllysning)
1ml / 3.5 cm diameter brunn (6-well) 5 ml / 75 ml flaska
- homogenisera genom att pipettera flera gånger (mekanisk lysis)
alternativ för rör: vortex 1 min alternativ för vävnad: För att undvika att vävnaden blir förvirrad: alternativt: mal 1 g vävnad i flytande kväve i en motar och pistill, lägg vävnaden i ett centrifugeringsrör med plastskruvkapsel + 15 ml TRIzol-reagens, inkubera proverna i 5 min i rumstemperatur eller 60° C (skalas upp efter behov)
- (5min vid RT för fullständig dissociation av nukleoproteinkomplex)
RNA är stabilt i trizol som deaktiverar RNaser. Du kan ta en paus vid detta tillfälle och behålla provet i trizol under en kortare tid eller frysa det under en längre tid.
fasseparation
15-45 min beroende på antalet prover och om en ytterligare kloroformtvätt är nödvändig
- tillsätt kloroform (1/5 volym trizol; e.t.ex. 0,2 ml till 1 ml)
- skaka i 15 sekunder (Eccles-protokoll: inte virvla)
- inkubera 2-5 min vid RT
- spin max. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
Om centrifugeringen inte har varit tillräcklig kommer den DNA-innehållande interfasen att vara molnig och dåligt komprimerad
Om supernatanten verkar grumlig kan ett ytterligare kloroformrengöringssteg sättas in här.
- överför den vattenhaltiga övre fasen till ett nytt rör
Var försiktig så att du inte suger upp den DNA-innehållande vita interfasen. Detta sker snabbt och kommer att leda till DNA-kontaminering i din RNA-prep.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
RNA-utfällning och tvätt
20-40 min beroende på antalet prover
- tillsätt isopropanol (70 % av den vattenhaltiga fasen eller 1/2 trizol-volym)
- 0,8 M natriumcitrat eller 1.2 M NaCl kan tillsättas
- (inkubera 10min vid RT)
- spin max g, 10-15 min, 4ºC
- avlägsna supernatanten
- (alternativ RNA-utfällning – RNeasy från Qiagen) bättre än alkoholutfällning för mindre mängder RNA (mindre risk för att förlora en miniknölsyrepellets); Minskar också risken för kontaminering med organiska lösningsmedel
Samma kit som RNeasy: MinElute-kit, eller Affymetrix provrensning
RNA tvätt
15-30 min beroende på antalet prover
- tvätta pellet 70% EtOH (tillsätt & vortex kort)
70% etanol beredd med RNase-fritt vatten
vissa föredrar att tvätta pelleten mer än en gång med 70% etanol
- spinn max g, 2-10 min, 4ºC
- lufttorka pelleten i 5-10 min
Torka inte pelleten för mycket, annars kommer du inte att kunna lösa upp den på nytt.
valfritt tillsätt RNashämmare
inkubera vid 55-60 C° i 10 min om den är svår att lösa upp på nytt
- överför till eppendorfrör
- spinn 4° C, 5 min (för att pelletera olöst material)
omlösning av RNA
- upplös pellet i 50-100 µl filtrerat eller DEPC H2O (observera: DEPC hämmar RT-reaktionen)
- alternativt, 0.5% SDS
pipettera upp och ner, värm till 55-60°C i 10 min
Högsta misstag
- använd för lite trizol; Mycket små volymer är svåra att separera och kommer sannolikt att leda till kontaminering
- Aspirera lite vit interfas (DNA) när du tar bort vattenhaltig supernatant (RNA)
- Använd fenol/kloroform med fel pH-värde (måste vara surt)
- Inte arbeta under huven (fenol är giftigt , kloroform är en narkotika )
Se även
- RNA-extraktion (central, allmän sida)
Reagens
- TRIZOL-reagens (Invitrogen), TRIZOL på wikipedia
- TRI-reagens (Sigmal Aldrich)
Protokoll
- RNA-extraktion med TRIZOL (Stanford)
- RNA-extraktion med TRIZOL (Uni Florida)
- Guide för felsökning av TRIZOL-extraktion (Uni Toronto)
- Phenol-kloroformextraktion av nukleinsyror på Wikipedia
Tips
- Ambion tips om RNA-extraktion