Extracção de RNA com TRIzol (nome do produto Invitrogen) ou o TRI equivalente (nome do produto Sigma-Aldrich) é um método comum de extracção total de RNA a partir de células baseado na pesquisa de Chomczynski P, Sacchi N. 1987 e revisto pelos autores novamente em 2006 . Leva um pouco mais tempo do que métodos baseados em colunas como o RNAeasy, mas tem maior capacidade e pode produzir mais RNA. Junto com os amortecedores de lise chaotrópica é geralmente considerado o método que dá o RNA de melhor qualidade.
Princípio
- isotiocianato de guanidínio (poderoso desnaturante protéico) -> inativação de RNases
- fenol/clorofórmio ácido -> partição do RNA em sobrenadante aquoso para separação
Nota: pH baixo é crucial, uma vez que em pH neutro o DNA não particiona o RNA na fase aquosa. Verifique o pH dos antigos reagentes TRIZOL/TRI!
Reagentes
- Reagente TRIzol ou TRI
Se quiser fazer os seus próprios reagentes, veja aqui extracção de RNA usando reagentes de guanidínio-ácido-fenol auto-fabricados
- 0.8 M citrato de sódio / 1.2 M NaCl
- isopropanol (2-propanol)
- clorofórmio
- 75% EtOH em DEPC H2O
- Água livre de rase (filtrada ou DEPC)
Passos
lise celular
lise celular leva apenas alguns minutos por poço, mas a homogeneização do tecido pode demorar 10-20 minutos por amostra, dependendo da resistência do tecido.
- (lavagem PBS)
- add trizol(lise celular)
1ml / 3.poço de 5 cm de diâmetro (6 poços) 5ml / 75 ml frasco
- homogenise por pipetar várias vezes (lise mecânica)
alternativa para tubos: vortex 1 min alternativa para tecidos: triturar 1 g de tecido em nitrogénio líquido num pilão e pilão, colocar tecido num tubo centrífugo de plástico de tampa de rosca + 15 ml de reagente TRIzol, incubar as amostras durante 5 min à temperatura ambiente ou 60° C (escalonado conforme necessário)
- (5min no RT para dissociação completa dos complexos nucleoproteicos)
RNA é estável em trizol que desactiva os RNases. Você pode fazer uma pausa neste ponto mantendo a amostra em trizol por um curto período de tempo ou congelando-a por um longo período.
separação de fases
15-45 min dependendo do número de amostras e se uma lavagem adicional de clorofórmio é necessária
- add clorofórmio (1/5 volume de trizol; e.g. 0,2ml a 1ml)
- agitar durante 15 seg. (Protocolo Eccles: não vortex)
- incubar 2-5 min a RT
- centrifugar no máximo. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
se a centrifugação não tiver sido suficiente, a interfase contendo DNA será semelhante a nuvens e mal compactada
Se o sobrenadante aparecer turvo, uma etapa adicional de limpeza com clorofórmio pode ser inserida aqui.
- transferir a fase superior aquosa para um novo tubo
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Cuidado para não aspirar a interface branca contendo DNA. Isto acontece rapidamente e levará à contaminação do DNA no seu RNA prep.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
Precipitação e lavagem do RNA
20-40 minutos dependendo do número de amostras
- add isopropanol (70% do volume da fase aquosa ou 1/2 trizol)
- 0,8 M de citrato de sódio ou 1.2 M de NaCl pode ser adicionado
- (incubar 10min na RT)
- spin max g, 10-15 min, 4ºC
- remove sobrenadante
- (precipitação alternativa de RNA – RNeasy from Qiagen) melhor que a precipitação de álcool para quantidades menores de RNA (menor risco de perda de uma minúscula partícula de ácido nucleico); também reduz o risco de contaminação por solventes orgânicos
kits semelhantes ao RNeasy: Kit MinElute, ou Affymetrix limpeza da amostra
lavagem do RNA
15-30 min. dependendo do número de amostras
- lavagem do pellet 70% EtOH (adicionar & vortex brevemente)
70% etanol preparado com água sem RNase-
alguns preferem lavar o pellot mais de uma vez com 70% de etanol
- centrifugação máxima g, 2-10 min., 4ºC
- pelete seca ao ar durante 5-10 min.
Não seque demasiado a pelete ou não conseguirá redissolvê-la.
opcional adicionar inibidor de RNase
incubar a 55-60 C° durante 10 min se for difícil de redissolver
- transferir para tubo eppendorf
- rodar a 4° C, 5 min (para sedimentar material não dissolvido)
redissolução do RNA
- dissolver sedimento em 50-100 µl filtrado ou DEPC H2O (nota: DEPC inibe a reação RT)
- alternativamente, 0.5% SDS
pipetting up and down, heat to 55-60°C for 10 min
Erros comuns
- usar muito pouco trizol; volumes muito pequenos são difíceis de separar e muito provavelmente levarão à contaminação
- aspirate alguma interfase branca (DNA) ao remover o sobrenadante aquoso (RNA)
- use fenol/clorofórmio do pH errado (tem de ser ácido)
- não trabalhe sob a capota (o fenol é tóxico , chloroform é um narcótico )
Veja também
- Extracção de RNA (central, página geral)
Reagentes
- Reagente TRIZOL (Invitrogen), TRIZOL na wikipedia
- Reagente TRI (Sigmal Aldrich)
Protocolos
- Extracção de RNA com TRIZOL (Stanford)
- Extracção de RNA com TRIZOL (Uni Florida)
- Guia de resolução de problemas para extracção de TRIZOL (Uni Toronto)
- Fenol-extracção de clorofórmio dos ácidos nucleicos na Wikipedia
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Dicas
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- Dicas de agregação na extracção de RNA