Die RNA-Extraktion mit TRIzol (Produktname Invitrogen) oder dem entsprechenden TRI (Produktname Sigma-Aldrich) ist eine gängige Methode der Gesamt-RNA-Extraktion aus Zellen, die auf den Forschungen von Chomczynski P, Sacchi N. 1987 beruht und von den Autoren 2006 erneut überprüft wurde. Sie dauert etwas länger als säulenbasierte Methoden wie RNAeasy, hat aber eine höhere Kapazität und kann mehr RNA liefern. Zusammen mit chaotropen Lysepuffern gilt es allgemein als die Methode, die die beste RNA-Qualität liefert.
Prinzip
- Guanidinium-Isothiocyanat (starkes Protein-Denaturierungsmittel) -> Inaktivierung von RNasen
- saures Phenol/Chloroform -> Partitionierung der RNA in den wässrigen Überstand für die Trennung
Hinweis: Ein niedriger pH-Wert ist entscheidend, da sich bei neutralem pH-Wert DNA und nicht RNA in der wässrigen Phase verteilt. Prüfen Sie den pH-Wert alter TRIZOL/TRI-Reagenzien!
Reagenzien
- TRIzol- oder TRI-Reagenz
Wenn Sie Ihre eigenen Reagenzien herstellen wollen, siehe hier RNA-Extraktion mit selbst hergestellten Guanidinium-Säure-Phenol-Reagenzien
- 0,8 M Natriumcitrat / 1.2 M NaCl
- Isopropanol (2-Propanol)
- Chloroform
- 75% EtOH in DEPC H2O
- RNase-freies Wasser (gefiltert oder DEPC)
Schritte
Zelllyse
Die Zelllyse dauert nur ein paar Minuten pro Vertiefung, aber die Homogenisierung von Gewebe kann 10-20 Minuten pro Probe dauern, je nachdem, wie zäh das Gewebe ist.
- (PBS waschen)
- Trizol hinzufügen(Zelllyse)
1ml / 3.5 cm Durchmesser Well (6-well) 5ml / 75 ml Flasche
- durch mehrmaliges Pipettieren homogenisieren (mechanische Lyse)
alternativ für Röhrchen: 1 min vortexen alternativ für Gewebe: 1 g Gewebe in flüssigem Stickstoff in einem Mörser und Stößel zerkleinern, Gewebe in ein Kunststoff-Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss + 15 ml TRIzol-Reagenz geben, Proben 5 min bei Raumtemperatur oder 60° C (je nach Bedarf) inkubieren
- (5min bei RT für vollständige Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe)
RNA ist in Trizol stabil, das RNasen deaktiviert. Sie können an dieser Stelle eine Pause einlegen und die Probe für kurze Zeit in Trizol belassen oder für längere Zeit einfrieren.
Phasentrennung
15-45 min je nach Anzahl der Proben und ob ein zusätzlicher Chloroform-Waschgang erforderlich ist
- Chloroform zugeben (1/5 Volumen Trizol; z.z. B. 0,2ml bis 1ml)
- schütteln für 15 sec (Eccles-Protokoll: nicht vortexen)
- inkubieren 2-5 min bei RT
- spinnen max. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
wenn die Zentrifugation nicht ausreichend war, wird die DNA-haltige Interphase wolkenartig und schlecht verdichtet sein
wenn der Überstand trübe erscheint, kann hier ein zusätzlicher Chloroform-Reinigungsschritt eingefügt werden.
- wässrige obere Phase in neues Röhrchen überführen
Aufpassen, dass die DNA-haltige weiße Interphase nicht aspiriert wird. Dies geschieht schnell und führt zu einer DNA-Kontamination in Ihrem RNA-Präparat.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
RNA-Fällung und Waschen
20-40 min je nach Anzahl der Proben
- Isopropanol hinzufügen (70% der wässrigen Phase oder 1/2 Trizol-Volumen)
- 0,8 M Natriumzitrat oder 1.2 M NaCl kann hinzugefügt werden
- (10min bei RT inkubieren)
- max g, 10-15 min, 4ºC
- Überstand entfernen
- (alternative RNA-Fällung – RNeasy von Qiagen) besser als Alkohol-Fällung für kleinere RNA-Mengen (geringeres Risiko, ein winziges Nukleinsäure-Pellet zu verlieren); reduziert auch das Risiko einer Kontamination durch organische Lösungsmittel
ähnliche Kits wie RNeasy: MinElute Kit, oder Affymetrix Probenreinigung
RNA waschen
15-30 min je nach Anzahl der Proben
- Pellet 70% EtOH waschen (& kurz vortexen)
70% Ethanol zubereitet mit RNase-freiem Wasser
manche bevorzugen es, das Pellet mehr als einmal mit 70% Ethanol zu waschen
- spin max g, 2-10 min, 4ºC
- Lufttrocknen des Pellets für 5-10 min
Das Pellet nicht zu sehr trocknen, sonst lässt es sich nicht wieder auflösen.
optional RNase-Inhibitor hinzufügen
bei 55-60 C° für 10 min inkubieren, wenn es sich schwer wieder auflösen lässt
- überführen in Eppendorf-Röhrchen
- auf 4° C drehen, 5 min (um ungelöstes Material zu pelletieren)
Rücklösung der RNA
- Pellet in 50-100 µl gefiltertem oder DEPC H2O auflösen (Hinweis: DEPC hemmt RT-Reaktion)
- alternativ, 0.5% SDS
auf- und abpipettieren, auf 55-60°C für 10 min erhitzen
Gängige Fehler
- zu wenig Trizol verwenden; sehr kleine Volumina sind schwer zu trennen und führen höchstwahrscheinlich zu Verunreinigungen
- beim Entfernen des wässrigen Überstands (RNA) etwas weiße Interphase (DNA) absaugen)
- Phenol/Chloroform mit falschem pH-Wert verwenden (muss sauer sein)
- nicht unter der Haube arbeiten (Phenol ist giftig , Chloroform ist ein Narkotikum )
Siehe auch
- RNA-Extraktion (zentrale, allgemeine Seite)
Reagenzien
- TRIZOL-Reagenz (Invitrogen), TRIZOL auf wikipedia
- TRI-Reagenz (Sigmal Aldrich)
Protokolle
- RNA-Extraktion mit TRIZOL (Stanford)
- RNA-Extraktion mit TRIZOL (Uni Florida)
- Troubleshooting guide for TRIZOL extraction (Uni Toronto)
- Phenol-Chloroform-Extraktion von Nukleinsäuren bei Wikipedia
Tipps
- Ambion Tipps zur RNA-Extraktion