La extracción de ARN con TRIzol (nombre del producto de Invitrogen) o el equivalente TRI (nombre del producto de Sigma-Aldrich) es un método común de extracción de ARN total de células basado en la investigación de Chomczynski P, Sacchi N. 1987 y revisado por los autores de nuevo en 2006 . Lleva un poco más de tiempo que los métodos basados en columnas como el RNAeasy, pero tiene mayor capacidad y puede producir más ARN. Junto con los tampones de lisis caotrópicos se considera generalmente el método que da la mejor calidad de ARN.
Principio
- isotiocianato de guanidinio (potente desnaturalizador de proteínas) -> inactivación de las RNasas
- fenol ácido/cloroformo -> partición del ARN en el sobrenadante acuoso para su separación
Nota: un pH bajo es crucial ya que a pH neutro el ADN no se particiona en la fase acuosa. Compruebe el pH de los reactivos TRIZOL/TRI antiguos.
Reactivos
- Reactivo TRIzol o TRI
Si quiere hacer sus propios reactivos, vea aquí RNA extraction using self-made guanidinium-acid-phenol reagents
- 0.8 M sodium citrate / 1.2 M NaCl
- isopropanol (2-propanol)
- cloroformo
- 75% EtOH en DEPC H2O
- Agua libre de RNasa (filtrada o DEPC)
Pasos
lisis celular
La lisis celular sólo lleva unos minutos por pocillo, pero la homogeneización de los tejidos puede llevar entre 10 y 20 minutos por muestra, dependiendo de la dureza del tejido.
- (lavado con PBS)
- añadir trizol(lisis celular)
1ml / 3.5 cm de diámetro (6 pocillos) 5ml / 75 ml botella
- homogeneizar pipeteando varias veces (lisis mecánica)
alternativa para tubos: vortex 1 min alternativa para tejido: moler 1 g de tejido en nitrógeno líquido en un motar y un mortero, poner el tejido en un tubo de centrífuga de plástico con tapa de rosca + 15 ml de reactivo TRIzol, incubar las muestras durante 5 min a temperatura ambiente o 60° C (escalar según sea necesario)
- (5min a RT para la disociación completa de los complejos nucleoproteicos)
El ARN es estable en trizol que desactiva las RNasas. Se puede hacer una pausa en este punto manteniendo la muestra en trizol durante un tiempo corto o congelándola durante uno más largo.
separación en fase
15-45 min dependiendo del número de muestras y de si es necesario un lavado adicional con cloroformo
- añadir cloroformo (1/5 de volumen de trizol; e.p. ej., de 0,2 ml a 1 ml)
- agitar durante 15 segundos (protocolo de Eccles: no agitar en vórtex)
- incubar 2-5 minutos a RT
- girar máx. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
si la centrifugación no ha sido suficiente, la interfase que contiene el ADN será turbia y poco compacta
Si el sobrenadante parece turbio, se puede insertar aquí un paso adicional de limpieza con cloroformo.
- transferir la fase superior acuosa a un nuevo tubo
Tener cuidado de no aspirar la interfase blanca que contiene el ADN. Esto ocurre rápidamente y conducirá a la contaminación del ADN en su preparación de ARN.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
Precipitación del ARN y lavado
20-40 min. dependiendo del número de muestras
- añadir isopropanol (70% de la fase acuosa o 1/2 volumen de trizol)
- 0,8 M de citrato de sodio o 1.2 M de NaCl
- (incubar 10min a RT)
- girar máx., 10-15 min, 4ºC
- retirar el sobrenadante
- (precipitación alternativa de ARN – RNeasy de Qiagen) mejor que la precipitación con alcohol para cantidades más pequeñas de ARN (menos riesgo de perder un minúsculo pellet de ácido nucleico); también reduce el riesgo de contaminación por disolventes orgánicos
kits similares a RNeasy: MinElute kit, o Affymetrix sample clean-up
RNA wash
15-30 min dependiendo del número de muestras
- wash pellet 70% EtOH (add & vortex briefly)
70% ethanol prepared with RNase-free water
algunos prefieren lavar el pellot más de una vez con 70% ethanol
- spin max g, 2-10 min, 4ºC
- secar el pellet al aire durante 5-10 min
No secar en exceso el pellet o no podrá redisolverlo.
añadir opcionalmente inhibidor de RNasa
incubar a 55-60 C° durante 10 min si es difícil de redisolver
- transferir a un tubo eppendorf
- girar a 4° C, 5 min (para pelletear el material no disuelto)
redisolver el ARN
- disolver el pellet en 50-100 µl de H2O filtrado o DEPC (nota: El DEPC inhibe la reacción de RT)
- alternativamente, 0.5% de SDS
subir y bajar el pellet, calentar a 55-60°C durante 10 min
Errores comunes
- utilizar muy poco trizol; volúmenes muy pequeños son difíciles de separar y lo más probable es que se contaminen
- aspirar algo de interfase blanca (ADN) al retirar el sobrenadante acuoso (ARN)
- utilizar fenol/cloroformo de pH incorrecto (tiene que ser ácido)
- no trabajar bajo la campana (el fenol es tóxico , el cloroformo es un narcótico )
Ver también
- Extracción de ARN (página central, general)
Reactivos
- Reactivo TRIZOL (Invitrogen), TRIZOL en wikipedia
- Reactivo TRI (Sigmal Aldrich)
Protocolos
- Extracción de ARN con TRIZOL (Stanford)
- Extracción de ARN con TRIZOL (Uni Florida)
- Guía de solución de problemas para la extracción con TRIZOL (Uni Toronto)
- Fenol-extracción de ácidos nucleicos con cloroformo en Wikipedia
Consejos
- Consejos para la extracción de ARN