RNA-ekstraktion med TRIzol (Invitrogen produktnavn) eller den tilsvarende TRI (Sigma-Aldrich produktnavn) er en almindelig metode til total RNA-ekstraktion fra celler baseret på forskning af Chomczynski P, Sacchi N. 1987 og revideret af forfatterne igen i 2006 . Den tager lidt længere tid end kolonnebaserede metoder som RNAeasy, men den har en højere kapacitet og kan give mere RNA. Sammen med chaotropiske lysisbuffere anses den generelt for at være den metode, der giver den bedste kvalitet af RNA.
Princip
- guanidinium isothiocyanat (kraftigt protein denatureringsmiddel) -> inaktivering af RNaser
- surt phenol/chloroform -> partitionering af RNA i vandig supernatant til separation
Note: lav pH er afgørende, da DNA ikke RNA ved neutral pH partitionerer i den vandige fase. Kontroller pH-værdien af gamle TRIZOL/TRI-reagenser!
Reagenser
- TRIzol- eller TRI-reagens
Hvis du ønsker at fremstille dine egne reagenser, se her RNA-ekstraktion ved hjælp af selvfremstillede guanidinium-syre-fenol-reagenser
- 0,8 M natriumcitrat / 1.2 M NaCl
- isopropanol (2-propanol)
- chloroform
- 75% EtOH i DEPC H2O
- RNasefrit vand (filtreret eller DEPC)
Steps
cellelysis
Cellelysis tager kun et par minutter pr. brønd, men homogenisering af væv kan tage 10-20 minutter pr. prøve, afhængigt af hvor hårdt vævet er.
- (PBS-vask)
- tilsæt trizol(cellelysis)
1 ml / 3.5 cm diameter brønd (6-well) 5ml / 75 ml flaske
- homogeniseres ved at pipettere flere gange (mekanisk lysis)
alternativ til rør: vortex 1 min alternativ til væv: 1 g væv males i flydende kvælstof i en motar og pistil, væv anbringes i centrifugerør med skruelåg + 15 ml TRIzol-reagens, prøverne inkuberes i 5 min ved stuetemperatur eller 60° C (opskaleres efter behov)
- (5min ved RT for fuldstændig dissociation af nukleoproteinkomplekser)
RNA er stabilt i trizol, som deaktiverer RNaser. Man kan holde en pause på dette tidspunkt ved at holde prøven i trizol i kort tid eller fryse den i længere tid.
faseseparation
15-45 min afhængigt af antallet af prøver og om en yderligere kloroformvask er nødvendig
- tilsæt kloroform (1/5 volumen af trizol; e.f.eks. 0,2 ml til 1 ml)
- skubbes i 15 sek. (Eccles-protokol: ikke vortex)
- inkuberes 2-5 min. ved RT
- spin max. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
hvis centrifugeringen ikke har været tilstrækkelig vil den DNA-holdige interfase være sky-lignende og dårligt komprimeret
Hvis supernatanten virker grumset, kan der indsættes et yderligere chloroform-rensetrin her.
- overfør den vandige øverste fase til et nyt rør
Pas på ikke at aspirere den DNA-holdige hvide grænseflade. Dette sker hurtigt og vil føre til DNA-kontaminering i din RNA-prep.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
RNA-udfældning og vask
20-40 min afhængigt af antallet af prøver
- tilsæt isopropanol (70% af den vandige fase eller 1/2 trizol-volumen)
- 0,8 M natriumcitrat eller 1.2 M NaCl kan tilsættes
- (inkubér 10min ved RT)
- spin max g, 10-15 min, 4ºC
- fjern supernatant
- (alternativ RNA-udfældning – RNeasy fra Qiagen) bedre end alkoholudfældning for mindre mængder RNA (mindre risiko for at miste en minisk lille nukleinsyrepellet); reducerer også risikoen for kontaminering med organiske opløsningsmidler
sammenlignende kits med RNeasy: MinElute-kit, eller Affymetrix prøveoprensning
RNA-vask
15-30 min afhængigt af antallet af prøver
- vaske pellet 70% EtOH (tilsæt & vortex kortvarigt)
70% ethanol tilberedt med RNase-fri vand
nogle foretrækker at vaske pellet mere end én gang med 70% ethanol
- spin max g, 2-10 min, 4ºC
- lufttørre pellet i 5-10 min
Pellet må ikke overtørres, ellers vil du ikke kunne opløse det igen.
eventuelt tilsættes RNaseinhibitor
inkuberes ved 55-60 C° i 10 min, hvis det er svært at opløse igen
- overføres til eppendorfrør
- spireres 4° C, 5 min (for at pelletere uopløst materiale)
genopløsning af RNA
- opløses pellet i 50-100 µl filtreret eller DEPC H2O (bemærk: DEPC hæmmer RT-reaktionen)
- alternativt, 0.5% SDS
pipettering op og ned, opvarmning til 55-60°C i 10 min
Fælles fejltagelser
- bruge for lidt trizol; meget små mængder er svære at adskille og vil højst sandsynligt føre til kontaminering
- aspirere noget hvid interfase (DNA) ved fjernelse af vandig supernatant (RNA)
- anvende phenol/chloroform med forkert pH-værdi (skal være sur)
- ikke arbejde under emhætte (phenol er giftigt , chloroform er et narkotisk stof )
Se også
- RNA-ekstraktion (central, generel side)
Reagenser
- TRIZOL-reagens (Invitrogen), TRIZOL på wikipedia
- TRI-reagens (Sigmal Aldrich)
Protokoler
- RNA-ekstraktion med TRIZOL (Stanford)
- RNA-ekstraktion med TRIZOL (Uni Florida)
- Fejlfindingsvejledning for TRIZOL-ekstraktion (Uni Toronto)
- Phenol-chloroform ekstraktion af nukleinsyrer på Wikipedia
Tips
- Ambion tips om RNA ekstraktion