L’extraction d’ARN à l’aide de TRIzol (nom de produit Invitrogen) ou de l’équivalent TRI (nom de produit Sigma-Aldrich) est une méthode courante d’extraction de l’ARN total des cellules basée sur les recherches de Chomczynski P, Sacchi N. 1987 et revue à nouveau par les auteurs en 2006 . Elle prend un peu plus de temps que les méthodes sur colonne comme RNAeasy, mais sa capacité est plus élevée et elle peut produire plus d’ARN. Avec les tampons de lyse chaotropiques, elle est généralement considérée comme la méthode qui donne la meilleure qualité d’ARN.
Principe
- isothiocyanate de guanidinium (puissant dénaturant des protéines) -> inactivation des RNases
- phénol/chloroforme acide -> partitionnement de l’ARN dans le surnageant aqueux pour la séparation
Note : un pH bas est crucial car à pH neutre l’ADN et non l’ARN se partitionne dans la phase aqueuse. Vérifier le pH des vieux réactifs TRIZOL/TRI!
Réactifs
- TRIzol ou réactif TRI
Si vous voulez faire vos propres réactifs, voir ici Extraction d’ARN en utilisant des réactifs guanidinium-acide-phénoliques faits maison
- Citrate de sodium 0,8 M / 1.2 M NaCl
- isopropanol (2-propanol)
- chloroforme
- Ethanol à 75 % dans DEPC H2O
- Eau sans RNase (filtrée ou DEPC)
Étapes
lyses cellulaires
La lyse cellulaire ne prend que quelques minutes par puits, mais l’homogénéisation des tissus peut prendre 10 à 20 minutes par échantillon selon la dureté du tissu.
- (lavage au PBS)
- addition de trizol(lyse cellulaire)
1ml / 3.5 cm de diamètre (6 puits) 5ml / 75 ml flacon
- homogénéiser en pipettant plusieurs fois (lyse mécanique)
alternative pour les tubes : vortex 1 min alternative pour les tissus : broyer 1 g de tissu dans l’azote liquide dans un motar et un pilon, mettre le tissu dans un tube de centrifugation à bouchon à vis en plastique + 15 ml de réactif TRIzol, incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante ou à 60° C (échelle selon les besoins)
- (5min à RT pour une dissociation complète des complexes nucléoprotéiques)
L’ARN est stable dans le trizol qui désactive les RNases. Vous pouvez faire une pause à ce stade en gardant l’échantillon dans le trizol pour une courte durée ou en le congelant pour une durée plus longue.
séparation de phase
15-45 min selon le nombre d’échantillons et si un lavage supplémentaire au chloroforme est nécessaire
- ajouter du chloroforme (1/5 de volume de trizol ; par ex.par exemple 0,2ml à 1ml)
- agiter pendant 15 sec (protocole Eccles : ne pas vortexer)
- incuber 2-5 min à RT
- tourner max. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
si la centrifugation n’a pas été suffisante, l’interphase contenant l’ADN sera nuageuse et peu compacte
Si le surnageant apparaît trouble, une étape supplémentaire de nettoyage au chloroforme peut être insérée ici.
- transférer la phase supérieure aqueuse dans un nouveau tube
Veiller à ne pas aspirer l’interface blanche contenant l’ADN. Cela se produit rapidement et entraînera une contamination de l’ADN dans votre préparation d’ARN.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
Précipitation de l’ARN et lavage
20-40 min selon le nombre d’échantillons
- ajouter de l’isopropanol (70% de la phase aqueuse ou 1/2 volume de trizol)
- Citrate de sodium 0,8 M ou 1.2 M NaCl peut être ajouté
- (incuber 10min à RT)
- tourner max g, 10-15 min, 4ºC
- éliminer le surnageant
- (précipitation alternative de l’ARN – RNeasy de Qiagen) meilleure que la précipitation à l’alcool pour les plus petites quantités d’ARN (moins de risque de perdre un minuscule culot d’acide nucléique) ; réduit également le risque de contamination par les solvants organiques
kits similaires à RNeasy : Kit MinElute, ou nettoyage des échantillons Affymetrix
Lavage ARN
15-30 min selon le nombre d’échantillons
- lavage du culot 70% EtOH (ajouter & vortex brièvement)
éthanol 70% préparé avec de l’eau sans RNase
certains préfèrent laver le culot plus d’une fois avec de l’éthanol 70%
- spin max g, 2-10 min, 4ºC
- séchage à l’air du culot pendant 5-10 min
Ne séchez pas trop le culot ou vous ne pourrez pas le redissoudre.
en option ajouter un inhibiteur de RNase
incuber à 55-60 C° pendant 10 min si difficile à redissoudre
- transférer dans un tube eppendorf
- spin à 4° C, 5 min (pour pelleter le matériel non dissous)
redissolution de l’ARN
- dissoudre le pellet dans 50-100 µl d’H2O filtré ou DEPC (note : Le DEPC inhibe la réaction RT)
- en alternative, 0.5% SDS
pipetage de haut en bas, chauffer à 55-60°C pendant 10 min
Les erreurs communes
- utiliser trop peu de trizol ; de très petits volumes sont difficiles à séparer et conduiront très probablement à une contamination
- aspirer un peu d’interphase blanche (ADN) lors de l’élimination du surnageant aqueux (ARN)
- utiliser du phénol/chloroforme de mauvais pH (doit être acide)
- ne pas travailler sous la hotte (le phénol est toxique , le chloroforme est un narcotique )
Voir aussi
- Extraction d’ARN (centrale, page générale)
Réactifs
- réactif TRIZOL (Invitrogen), TRIZOL sur wikipedia
- Réactif TRI (Sigmal Aldrich)
Protocoles
- Extraction d’ARN avec TRIZOL (Stanford)
- Extraction d’ARN avec TRIZOL (Uni Florida)
- Guide de dépannage pour l’extraction TRIZOL (Uni Toronto)
- Extraction phénol-chloroforme.chloroforme d’acides nucléiques sur Wikipedia
Tips
- Conseils d’Ambion sur l’extraction d’ARN
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