RNA:n uuttaminen TRIzolilla (Invitrogenin tuotenimi) tai vastaavalla TRI:llä (Sigma-Aldrichin tuotenimi) on yleinen menetelmä RNA:n totaalipoistoon soluista, joka perustuu Chomczynski P:n ja Sacchi N:n tutkimukseen (Chomczynski P, Sacchi N., 1987) ja jonka kirjoittajat tarkastelivat uudelleen uudelleen vuonna 2006. Se kestää hieman kauemmin kuin kolonnipohjaiset menetelmät, kuten RNAeasy, mutta sen kapasiteetti on suurempi ja sillä voidaan saada enemmän RNA:ta. Yhdessä kaoottisten lyysipuskurien kanssa sitä pidetään yleisesti menetelmänä, jolla saadaan parhaiten laadukasta RNA:ta.
PERIAATE
- guanidinium-isotiosyanaatti (voimakas proteiinien denaturointiaine) -> RNaasien inaktivointi
- hapan fenoli/kloroformi -> RNA:n jakautuminen vesipitoiseen supernatanttiin erottelua varten
Huomautus: matala pH-arvo on ratkaisevan tärkeä, sillä neutraalissa pH-arvossa DNA, ei siis enää RNA, jakaantuu vesifaasiin. Tarkista vanhojen TRIZOL/TRI-reagenssien pH!
Reagenssit
- TRIzol- tai TRI-reagenssi
Jos haluat tehdä omia reagensseja, katso täältä RNA:n uuttaminen käyttäen itsetehtyjä guanidiniumhappo-fenolireagensseja
- 0,8 M natriumsitraattia / 1.2 M NaCl
- isopropanoli (2-propanoli)
- kloroformi
- 75-prosenttinen EtOH DEPC H2O:ssa
- RNAASIVAPAA VESI (suodatettu tai DEPC)
Vaiheet
solujen lyysaaminen
Solujen lyysaaminen vie vain muutaman minuutin kuoppaa kohti, mutta kudosten homogenisointi voi kestää 10-20 minuuttia näytettä kohti riippuen siitä, kuinka sitkeää kudos on.
- (PBS-pesu)
- lisää trizolia(solulyysi)
1ml / 3.5 cm halkaisijaltaan oleva kuoppa (6-well) 5ml / 75 ml pullo
- homogenisoidaan pipetoimalla useita kertoja (mekaaninen lyysi)
vaihtoehto putkille: vortex 1 min vaihtoehto kudoksille:
- (5min RT:ssä nukleoproteiinikompleksien täydelliseen dissosiaatioon)
RNA on stabiilia trizolissa, joka deaktivoi RNaasit. Voit pitää tässä vaiheessa tauon pitämällä näytettä trizolissa lyhyen aikaa tai pakastamalla sitä pidempään.
faasierotus
15-45 min riippuen näytteiden määrästä ja siitä, tarvitaanko lisäkloroformihuuhtelua
- lisää kloroformia (1/5 tilavuudesta trizolia; esim.esim. 0,2 ml:sta 1 ml:aan)
- ravistellaan 15 sekuntia (Ecclesin protokolla: ei saa vorteksoida)
- inkuboidaan 2-5 min RT:ssä
- pyöritetään max. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
jos sentrifugointi ei ole ollut riittävää, DNA:ta sisältävä interfaasi on pilvimäinen ja huonosti tiivistynyt
Jos supernatantti vaikuttaa samealta, tähän voidaan lisätä ylimääräinen kloroformipuhdistusvaihe.
- siirrä vesipitoinen ylempi faasi uuteen putkeen
Varo, ettet ime DNA:ta sisältävää valkoista rajapintaa. Tämä tapahtuu nopeasti ja johtaa DNA-kontaminaatioon RNA-prepissäsi.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
RNA:n saostus ja pesu
20-40 min näytteiden määrästä riippuen
- lisää isopropanolia (70 % vesifaasista tai 1/2 trizolin tilavuudesta)
- 0,8 M natriumsitraattia tai 1.2 M NaCl voidaan lisätä
- (inkuboidaan 10min RT:ssä)
- pyöritetään max g, 10-15 min, 4ºC
- poistetaan supernatantti
- (vaihtoehtoinen RNA-saostaminen – RNeasy Qiagenilta) parempi kuin alkoholi-saostaminen pienemmille määrille RNA:aa (pienempi vaara menettää minikokoinen nukleiinihappopelletti); vähentää myös orgaanisten liuottimien kontaminaatioriskiä
samankaltaiset sarjat kuin RNeasy: MinElute kit, tai Affymetrix-näytteiden puhdistus
RNA-pesu
15-30 min näytteiden määrästä riippuen
- huuhtele pelletti 70 % EtOH:lla (lisää & vorteksoi lyhyesti)
70 %:n etanoli, joka on valmistettu RNaasivapaalla vedellä
jotkut pesevät mieluummin useamman kerran 70 %:lla etanolilla
- pyöräytä max. g, 2-10 min, 4ºC
- ilmakuivaa pellettiä 5-10 min
Älä kuivaa pellettiä liikaa, sillä muuten et pysty liuottamaan sitä uudelleen.
valinnaisesti lisää RNaasi-inhibiittori
inkuboi 55-60 C°:ssa 10 min, jos vaikea liuottaa uudelleen
- siirrä eppendorf-putkeen
- pyöritä 4° C:ssa, 5 min (liukenemattoman materiaalin pelletöimiseksi)
RNA:n uudelleenliuotus
- liuotetaan pelletti 50-100 µl:aan suodatettua tai DEPC H2O:ta (huom: DEPC estää RT-reaktion)
- vaihtoehtoisesti 0.5 % SDS
pipetointi ylös ja alas, kuumenna 55-60 °C:een 10 min
Yleiset virheet
- käytä liian vähän trizolia; hyvin pieniä määriä on vaikea erottaa toisistaan ja johtaa todennäköisesti kontaminaatioon
- hakee jonkin verran valkoista interfaasia (DNA) poistaessaan vesipitoista supernatanttia (RNA)
- käyttää väärän pH:n fenolia/kloroformia (sen on oltava hapanta)
- ei työskennellä hupun alla (fenoli on myrkyllistä , kloroformi on narkoottinen )
Katso myös
- RNA:n uuttaminen (keskeinen, yleinen sivu)
Reagenssit
- TRIZOL-reagenssi (Invitrogen), TRIZOL wikipediassa
- TRI-reagenssi (Sigmal Aldrich)
Protokollat
- RNA:n uuttaminen TRIZOL:lla (Stanford)
- RNA:n uuttaminen TRIZOL:lla (Uni Floridassa)
- TRIZOL:n uuttamisohjeet (Uni Torontossa)
- Fenoli-chloroform extraction of nucleic acids at Wikipedia
Vinkkejä
- Ambionin vinkkejä RNA:n uuttamiseen