Trizol/tri

TRIzol (Invitrogen product name) または同等のTRI (Sigma-Aldrich product name) によるRNA抽出は、Chomczynski P, Sacchi N. 1987の研究に基づいて細胞から全RNA抽出する方法として一般的ですが、著者らが2006年に再びレビューを行っております。 RNAeasyのようなカラムを用いた方法よりも若干時間がかかるが、容量が大きく、より多くのRNAを得ることができる。 カオトロピックライシスバッファと並んで、一般的に最も高品質のRNAを得ることができる方法と考えられている。

原理

  • guanidinium isothiocyanate（強力なタンパク質変性剤） -> RNaseの不活性化
  • acidic phenol/chloroform -> 水性上清にRNAを分配して分離

注：中性ではRNAではなくDNAが水性相に分配されるので低pHは重要である。 古いTRIZOL/TRI試薬のpHを確認する！

試薬

  • TRIzol or TRI reagent

もし自分で試薬を作りたい場合はこちらを参照 自作のグアニジニウム酸-フェノール試薬を用いたRNA抽出

  • 0.8M sodium citrate / 1.8M sodium citrate / 1.2 M NaCl
  • isopropanol (2-propanol)
  • chloroform
  • 75% EtOH in DEPC H2O
  • RNase free water (filtered or DEPC)

ステップ

cell lysis

細胞溶解は1 well あたり数分しか掛かりません。 しかし、組織のホモジナイズは、組織の硬さにもよりますが、1サンプルあたり10～20分かかることがあります。

  • (PBS wash)
  • add trizol(cell lysis)

1ml / 3.5 cm径のウェル（6ウェル） 5ml / 75mlボトル

  • homogenise by pipetting several times (mechanic lysis)

alternative for tubes: vortex 1 min alternative for tissue: 液体窒素中の1gの組織をモタールと乳棒ですり潰し、プラスチック製スクリューキャップ遠心管に組織を入れ、15mlのTRIzol試薬、室温または60℃で5分間インキュベート（必要に応じてスケールアップ）

  • （核タンパク質複合体を完全に解離するために5分間RT）

RNaseが不活性化されているので、トリゾール中で安定である。 401>

phase separation

15-45 min depending on the number of samples and whether the additional chloroform wash is necessary

  • add chloroform (1/5 volume of trizol; e.g.).0.2mlから1ml）
  • 15秒間シェイク（Ecclesプロトコル：ボルテックスしない）
  • インキュベート 2-5 min at RT
  • spin max. もし遠心分離が十分でなければ、DNAを含む界面相は曇ったような状態になり、圧縮されなくなります

    もし上清が濁ったように見えたら、ここで追加のクロロホルム洗浄ステップを入れます。 これはすぐに起こり、RNAプレパラートにDNAが混入する原因になります。

    TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)

    RNA 沈殿と洗浄

    サンプル数により20～40分

    • isopropanol (70% of aqueous phase or 1/2 trizol volume)
    • 0.8M sodium citrate or 1.M. trizolを加えて、1.5mlの水相にします。2M NaClを加えることも可能です
    • （常温で10分間インキュベート）
    • spin max g, 10-15 min, 4ºC
    • 上清除去
    • (alternative RNA precipitation – RNeasy from Qiagen) 少量のRNAをアルコール沈殿よりもよく分離します（微量の核酸ペレットの損失リスクが低くなります）。 また、有機溶媒によるコンタミネーション

    RNeasyに類似したキット。 MinEluteキット。 or Affymetrix sample clean-up

    RNA wash

    15-30 min depending on the number of samples

    • wash pellet 70% EtOH (add & vortex briefly)

    70% ethanol prepared with RNase-free water

    some prefer to wash more than once with 70% ethanol

    • spin max g, 2-10 min, 4ºC
    • air-dry pellet for 5-10 min オーバードライにすると、再溶解できなくなります。

    optional add RNase inhibitor

    incubate at 55-60 C° for 10 min if hard to redissolve

    • transfer to eppendorf tube
    • spin 4° C.に移し替える。 5分（未溶解物をペレット化）

    RNAの再溶解

    • ペレットを50-100μlのフィルターまたはDEPC H2Oに溶解する（注。 DEPCはRT反応を阻害する）
    • あるいは、0.5% SDS

    上下にピペッティングし、55-60℃で10分間加熱

    Common mistakes

    • use too little trizol;
    • 水性上清（RNA）を除去する際に、白い間相（DNA）を吸引してしまう
    • 誤ったpHのフェノール/クロロホルム（酸性でなければならない）を使用する
    • フード下で作業をしない（フェノールは毒性がある。 クロロホルムは麻薬 )

    See also

    • RNA extraction (central, general page)

    Reagents

    • TRIZOL reagent (Invitrogen).All rights reserved, TRIZOL on wikipedia
    • TRI試薬（Sigmal Aldrich）

    プロトコル

    • TRIZOLによるRNA抽出（Stanford）
    • TRIZOLによるRNA抽出（Uni Florida）
    • Troubleshooting Guide for TRIZOL extraction (Uni Toronto)
    • Phenol->
    • RNA extraction with TriZOL (Uni Florida)
    • Troubleshooting guide with TRIZOL extraction (Uni Toronto)

      • RNA extraction with TRIZOL (Stanford)

    • TRIZOL (Stanford)Wikipediaの核酸のクロロホルム抽出

    Tips

    • Ambion RNA抽出のヒント

    にて。

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