RNA-extractie met TRIzol (productnaam Invitrogen) of het equivalent TRI (productnaam Sigma-Aldrich) is een gangbare methode voor totale RNA-extractie uit cellen op basis van het onderzoek van Chomczynski P, Sacchi N. 1987 en herzien door de auteurs opnieuw in 2006 . Het duurt iets langer dan kolom-gebaseerde methoden zoals RNAeasy, maar het heeft een hogere capaciteit en kan meer RNA opleveren. Samen met chaotropische lysisbuffers wordt het algemeen beschouwd als de methode die de beste kwaliteit RNA geeft.
Principe
- guanidiniumisothiocyanaat (krachtige eiwit denaturerende) -> inactivering van RNasen
- zure fenol/chloroform -> verdeling van RNA in waterig supernatant voor scheiding
Note: lage pH is van cruciaal belang omdat bij neutrale pH DNA niet RNA partities in de waterige fase. Controleer de pH van oude TRIZOL/TRI-reagentia!
Reagentia
- TRIzol of TRI-reagens
Als u uw eigen reagentia wilt maken, zie hier RNA-extractie met zelfgemaakte guanidiniumzuur-fenolreagentia
- 0,8 M natriumcitraat / 1.2 M NaCl
- isopropanol (2-propanol)
- chloroform
- 75% EtOH in DEPC H2O
- RNase vrij water (gefilterd of DEPC)
stappen
cellyse
cellyse van cellen duurt slechts een paar minuten per putje, maar het homogeniseren van weefsel kan 10-20 minuten per monster duren, afhankelijk van hoe taai het weefsel is.
- (PBS wassen)
- trizol toevoegen(cell lysis)
1ml / 3.5 cm diameter well (6-well) 5ml / 75 ml fles
- homogeniseer door meerdere malen te pipetteren (mechanische lysis)
alternatief voor buizen: vortex 1 min alternatief voor weefsel: maal 1 g weefsel in vloeibare stikstof in een moter en stamper, doe weefsel in plastic centrifugebuis met schroefdop + 15 ml TRIzol-reagens, incubeer monsters 5 min bij kamertemp of 60° C (naar behoefte opgeschaald)
- (5min bij RT voor volledige dissociatie van nucleoproteïnecomplexen)
RNA is stabiel in trizol dat RNases deactiveert. U kunt een pauze op dit punt te houden van het monster in trizol voor een korte tijd of invriezen voor een langere.
phase scheiding
15-45 min afhankelijk van het aantal monsters en of een extra chloroform wassen nodig is
- voeg chloroform (1/5 volume van trizol; e..b.v. 0.2ml tot 1ml)
- schudden gedurende 15 sec (Eccles-protocol: niet vortexen)
- incubeer 2-5 min. bij RT
- spin max. 12000g, 5-15 min, 2-8°C
als het centrifugeren niet voldoende is geweest, zal de DNA-bevattende interfase troebel en slecht verdicht zijn
Als het supernatans troebel lijkt, kan hier een extra chloroformreinigingsstap worden ingelast.
- waterige bovenfase overbrengen in nieuwe buis
Let erop dat u de DNA-bevattende witte interface niet opzuigt. Dit gebeurt snel en zal leiden tot DNA-verontreiniging in uw RNA prep.
TRIZOL phases after chloroform addition TOP - colourless aqueous phase (RNA) - 60% TRIZOL volumeMIDDLE - interphase (DNA)BOTTOM - red (organic) phenol-chloroform phase (proteins & lipids)
RNA precipitatie en wassen
20-40 min afhankelijk van het aantal monsters
- add isopropanol (70% van de waterige fase of 1/2 trizol volume)
- 0,8 M natriumcitraat of 1.2 M NaCl kan worden toegevoegd
- (incubeer 10min bij RT)
- spin max g, 10-15 min, 4ºC
- verwijder supernatant
- (alternatieve RNA-precipitatie – RNeasy van Qiagen) beter dan alcoholprecipitatie voor kleinere hoeveelheden RNA (minder risico op verlies van een miniscuul nucleïnezuurpellet); vermindert ook het risico van verontreiniging met organische oplosmiddelen
Soortgelijke kits als RNeasy: MinElute kit, of Affymetrix monster clean-up
RNA wassen
15-30 min, afhankelijk van het aantal monsters
- pellet 70% EtOH wassen (toevoegen & kort vortexen)
70% ethanol bereid met RNase-vrij water
sommigen geven er de voorkeur aan de pellet meer dan eens te wassen met 70% ethanol
- spin max g, 2-10 min, 4ºC
- droog de pellet aan de lucht gedurende 5-10 min
Droog de pellet niet te veel of u zult hem niet opnieuw kunnen oplossen.
optioneel RNase inhibitor
incubeer bij 55-60 C° gedurende 10 min indien moeilijk te redissolve
- overbrengen naar eppendorf buis
- spin 4° C, 5 min (om onopgelost materiaal te pelleteren)
oplossen van RNA
- los pellet op in 50-100 µl gefilterd of DEPC H2O (let op: DEPC remt RT reactie)
- alternatief, 0.5% SDS
op en neer pipetteren, verhitten tot 55-60°C gedurende 10 min
Voorkomende fouten
- te weinig trizol gebruiken; zeer kleine volumes zijn moeilijk te scheiden en zullen hoogstwaarschijnlijk tot contaminatie leiden
- aspireer wat witte interfase (DNA) bij het verwijderen van waterig supernatans (RNA)
- gebruik fenol/chloroform van de verkeerde pH (moet zuur zijn)
- werk niet onder de kap (fenol is giftig , chloroform is een verdovend middel)
Zie ook
- RNA extractie (centrale, algemene pagina)
Reagenten
- TRIZOL reagens (Invitrogen), TRIZOL op wikipedia
- TRI-reagens (Sigmal Aldrich)
Protocollen
- RNA-extractie met TRIZOL (Stanford)
- RNA-extractie met TRIZOL (Uni Florida)
- Gids voor het oplossen van problemen bij TRIZOL-extractie (Uni Toronto)
- Phenol-chloroform extractie van nucleïnezuren bij Wikipedia
Tips
- Ambion tips over RNA extractie